朱向情，王 強(qiáng)，蔡學(xué)敏，李自安，龐榮清，潘興華

衰老是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)譜及表達(dá)水平、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制發(fā)生改變，導(dǎo)致生物活性分子、組織細(xì)胞及其組成成分、組織結(jié)構(gòu)以及器官功能逐漸退化的生理過程。關(guān)于衰老發(fā)生學(xué)說，有體細(xì)胞突變、自由基、差錯災(zāi)難、脂褐素累積、內(nèi)分泌功能減退等[1]，這些學(xué)說從不同角度解釋了衰老發(fā)生的原因，但均存在片面性。最近研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體免疫功能降低或紊亂、慢性炎癥是機(jī)體衰老的重要原因[2]，但調(diào)控機(jī)制尚不清楚。外周血單個核細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答和防御的主要細(xì)胞組分，miRNA是一種含有約22個核苷酸的非編碼小分子RNA，不具編碼功能，但能夠與靶mRNA結(jié)合并調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞生物進(jìn)程[3]。miRNA對衰老相關(guān)基因表達(dá)也具有調(diào)控作用，已發(fā)現(xiàn)了mir-499、mir-34c等衰老調(diào)節(jié)miRNA，但數(shù)據(jù)十分有限[4]。本研究采用二代測序生物信息分析技術(shù)，研究了中年與老年獼猴外周血中單個核細(xì)胞的miRNA的表達(dá)差異及其靶基因，為揭示衰老發(fā)生機(jī)制提供新的科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取8周歲和20～21周歲雌性健康獼猴各3只，分別設(shè)為中年組、老年組。每只采集外周血3.0 ml，用于單個核細(xì)胞分離和miRNA提取。所有獼猴均由中國科學(xué)院昆明動物學(xué)研究所動物中心提供，均飼養(yǎng)于醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物使用經(jīng)過醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)，所有動物在普通級環(huán)境下、按照常規(guī)條件飼養(yǎng)。

1.2 miRNA測序及數(shù)據(jù)預(yù)處理 miRNA測序委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成，使用Illumina公司Hiseq 4000測序儀測序。對測序產(chǎn)生的原始Fastq格式文件數(shù)據(jù)進(jìn)行引物與載體序列去除、測序片段堿基的質(zhì)量檢驗(yàn)和長度篩選等，篩選高質(zhì)量的測序片段。數(shù)據(jù)預(yù)處理通過perl腳本完成。

1.3 miRNA的識別 經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理后，根據(jù)Read長度統(tǒng)計(jì)片段長度分布情況，長度在21～25 nt的Read視為預(yù)測的miRNA。采用Bowtie軟件[5]將miRNA序列與miRBase數(shù)據(jù)庫中的miRNA進(jìn)行比對，比對上的序列為已知miRNA。將未比對上的序列與Rfam數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，去除可能存在的其他類型的小RNA，將過濾后的序列與猴轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對，去除由降解mRNA測序產(chǎn)生的序列。將未同轉(zhuǎn)錄組序比對上的序列與RepBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，去除重復(fù)序列。剩余序列采用miRDeep2軟件[6]結(jié)合猴同源miRNA序列以及RNAfold軟件預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)，識別新的miRNA。

1.4 miRNA差異分析 比對已知的miRNA序列，進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)以及差異分析，miRNA表達(dá)量計(jì)算采用TPM計(jì)算度量指標(biāo)，TPM是指以每百萬比配成對序列做miRNA表達(dá)量指標(biāo)，利用DESeq2軟件包[7]中的負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)計(jì)算基因差異表達(dá)量。采用NB（負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式）對reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，根據(jù)P＜0.05篩選出差異表達(dá)miRNA。

1.5 差異miRNA靶基因預(yù)測 對差異表達(dá)分析得到的miRNA，利用miranda算法預(yù)測miRNA靶基因。miranda算法是基于miRNA-3'UTR序列匹配與能量穩(wěn)定性評估計(jì)算步驟綜合預(yù)測miRNA靶基因，該算法采用動態(tài)規(guī)劃算法搜索miRNA與3'UTR互補(bǔ)同時(shí)穩(wěn)定形成雙鏈的區(qū)域，預(yù)測miRNA靶基因過程中所使用到的閾值參數(shù)為：S＞=150，ΔG＜=-30 kcal/mol和 Demand strict 5'seed pairing。其中S指匹配區(qū)域內(nèi)single-residue-pair match scores；ΔG是雙鏈形成時(shí)的自由能。

1.6 預(yù)測靶基因GO和KEGG富集分析 利用Bioconductor（3.4 版本）（http://www.bioconductor.org/）項(xiàng)目中的GO和KEGG富集分析軟件包c(diǎn)lusterProfiler（3.2.10版本），對預(yù)測到的差異miRNA靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)miRNA 共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)miRNA 55個，其中21為已知miRNA（表1），在這些已知差異表達(dá)miRNA中，表達(dá)上調(diào)的有4個，分別為miR-449a-5p、miR-135a-1-3p、miR-9-5p 和 miR-615-3p；表達(dá)下調(diào)的有17個。發(fā)現(xiàn)新的差異表達(dá)的miRNA 34個，其中上調(diào)和下調(diào)miRNA分別為11個和23個，這些新miRNA的作用靶基因上不清楚。根據(jù)P值大小，前10個差異表達(dá)miRNA的信息見表2。

2.2 差異miRNA的靶基因預(yù)測 對21個已知差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，共找到1634個靶基因，其中值最小的miR-1262-3p預(yù)測到3個靶基因，分別為：VPS18 （基因登錄號：NM_001257653.1）、FGF14（基因登錄號：XM_015121402.1）和 FAM167A（基因登錄號：XM_015144755.1）。

2.3 靶基因GO分析 對P≤0.05的已知miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其作用靶基因有1492個。進(jìn)一步對靶基因進(jìn)行GO聚類分析，證明這些基因主要設(shè)計(jì)生物進(jìn)程、細(xì)胞組份和分子功能方面。與生物進(jìn)程相關(guān)的靶基因主要涉及轉(zhuǎn)錄及調(diào)控、細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化等（圖1A），與細(xì)胞組份相關(guān)的靶基因主要涉及細(xì)胞膜、核、質(zhì)膜、細(xì)胞液等（圖1B），與分子功能相關(guān)的靶基因主要涉及與ATP結(jié)合、DNA結(jié)合、RNA結(jié)合分子等（圖1C）。

2.4 miRNA靶基因KEGG通路富集分析 對靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因主要富集在35條信號通路上，其中前20個顯著富集的KEGG通路見圖2，所涉及的KEGG通路主要包括胰島素分泌、MAPK、PI3K-Akt、wnt、mTOR 信號通路及與細(xì)胞凋亡信號通路和免疫相關(guān)的toll樣受體信號通路等。

圖1GO聚類分析顯示顯著富集的前20個GO term柱狀圖

圖2 富集的前20個KEGG通路柱狀圖

3 討論

miRNA是機(jī)體中參與衰老調(diào)控的一類重要分子，其調(diào)控方式主要是通過堿基配對結(jié)合到衰老相關(guān)基因的mRNA的3'末端非編碼區(qū)，影響mRNA的翻譯，進(jìn)而影響衰老進(jìn)程[3，8]。有研究報(bào)道，mir-499、mir-34c、mir-1285、mir-34a 等 miRNA 能夠通過與靶基因結(jié)合影響細(xì)胞衰老進(jìn)程[8]。本研究共發(fā)現(xiàn)55個在中年與老年獼猴單個核細(xì)胞中有顯著差異表達(dá)的miRNA，其中21個miRNA已被注釋，上調(diào)的 4個 miRNA分別為 miR-135a-1-3p、miR-449a-5p、miR-615-3p和miR-9-5p，提示這些下調(diào)或上調(diào)miRNA的差異表達(dá)參與了機(jī)體衰老進(jìn)程。進(jìn)一步55個差異表達(dá)的miRNA共調(diào)控1634個靶基因。對這些靶基因進(jìn)行GO分析結(jié)果顯示，這些靶基因的作用主要涉及生物進(jìn)程、細(xì)胞組份及ATP、DNA、RNA結(jié)合功能等；KEGG富集結(jié)果顯示，這些靶基因主要被顯著富集在胰島素分泌、wnt以及mTOR等與衰老相關(guān)的通路上，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和衰老等[9]。本研究發(fā)現(xiàn)的miRNA可以通過調(diào)控這些通路中的關(guān)鍵基因表達(dá)來促進(jìn)或延緩細(xì)胞衰老，可為臨床上衰老相關(guān)疾病的診斷提供新的候選因子，也為衰老相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。

表1 識別的差異表達(dá)的已知miRNA

表2 新發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)miRNA