李麗春，陳 瑤，付 梅，何 謙

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一[1]，近幾年其在診斷和治療方式上都有一定的進展，但是其5年生存期仍然較低，主要原因是其發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）在細胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用，近年來在腫瘤的演進中受到關注，并且認為其是導致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的主要機制之一[3]。有文獻報道，其參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。EMT過程中，上皮細胞標志物E-cadherin下降，間質(zhì)細胞標志物N-cadherin上調(diào)，導致細胞獲得一定的運動能力[5]，同時Slug、Snail作為轉(zhuǎn)錄因子也參與EMT過程[6]。S100A4基因定位于1號染色體長臂2區(qū)1帶，其表達的蛋白是鈣結(jié)合蛋白S100家族的主要成員之一，其主要功能是調(diào)節(jié)細胞粘附能力。有研究報道，S100A4在乳腺癌、胃癌、鼻咽癌、甲狀腺癌、膀胱癌等腫瘤組織中高表達[7-8]。有文獻提示，S100A4可能也參與與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且與乳腺癌的臨床病理參數(shù)以及預后相關，但S100A4是否是通過調(diào)節(jié)EMT過程進而影響乳腺癌的臨床病理變化及預后[9]，目前尚未完全清楚。因此，本實驗研究了沉默S100A4基因?qū)θ橄侔〦MT過程的影響，為進一步闡明乳腺癌的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設備 MCF-7和MDA-MB-231細胞購自上海生物制品研究所；S100A4和非特異性陰性對照序列的siRNA購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司；胎牛血清和青、鏈霉素溶液、DMEM購自美國 Gibco公司，TRIzol和 RT試劑盒購自大連TaKaRa公司，SYBR Green PCR混合液購自美國Life technology公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒、RIPA細胞裂解液裂解均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。所用引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，Lipoctamine2000購自美國 Thermo Fisher Scientific公司 ，實驗所用一抗（β-actin，Slug，N-cadherin，S100A4和Snail）均購自美國Cell Signaling Technology公司，E-cadherin購自美國Abcam公司，抗兔 IgG(H+L)、 抗鼠 IgG(H+L)、Super ECL Plus Western Blotting Substrate化學發(fā)光顯影液、DEPC水均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；凝膠圖像分析系統(tǒng)和PCR儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞與組織標本 MCF-7和MDA-MB-231細胞于 37℃、5%CO2、95%大氣條件下培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基。本實驗所用細胞均處于對數(shù)生長期。

組織樣本來自醫(yī)院乳腺外科收治的4例乳腺癌患者，均經(jīng)3位病理醫(yī)生診斷，組織學類型均為原發(fā)浸潤性導管癌。腫瘤組織和正常組織標本分別取自瘤體和距離瘤體2 cm外正常乳腺組織。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，所有參與研究的患者知曉本研究并簽署了知情同意書。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染和分組 將S100A4和非特異性陰性對照序列的siRNA分別轉(zhuǎn)染至人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞，分別作為S100A4基因沉默組（基因沉默組）和陰性對照組，轉(zhuǎn)染步驟按脂質(zhì)體Lipoctamine2000說明書操作。

1.4 Western blot實驗 Western blot實驗檢測S100A4蛋白在人乳腺癌組織樣本中的表達水平以及 S100A4、N-cadherin、E-cadherin、Slug、Snail 蛋 白在基因沉默組和陰性對照組中的表達水平。方法概述如下：轉(zhuǎn)染了siRAN和陰性對照的細胞或者新鮮組織收集于1.5 ml的EP管中，用RIPA細胞裂解液裂解，BCA方法測量蛋白濃度。實驗的蛋白樣本用RIPA調(diào)整至相同的濃度，蛋白樣品上樣電泳2 h后轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，一抗孵育過夜(4℃)；次日用TBST浸洗1 h，然后用對應的二抗孵育 2 h，TBST浸洗 45 min，最后用 Super ECL Plus Western Blotting Substrate化學發(fā)光顯影液顯影。

1.5 RT-PCR 檢測S100A4基因在人乳腺癌組織樣本中的表達水平以及 S100A4、N-cadherin、E-cadherin、Slug、Snail基因在 S100A4 基因沉默組（沉默組）和陰性對照組（對照組）中的表達水平。方法概述如下：采用TRIzol法提取組織樣本或者細胞mRNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA。反應體系如下：2 μg的mRNA加8 μl的5×primeScript mix緩沖液，然后用DEPC水補充至40 μl。然后進行實時熒光定量PCR，方法參照RT試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒說明書。各組基因表達的相對差異用循環(huán)數(shù)(ct)表示，每個樣品的ct值用B-actin進行校正，

1.6 統(tǒng)計學方法 應用PASW Statistics統(tǒng)計軟件進行分析，Graghpad Prism 6.2軟件進行統(tǒng)計圖制作。計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較時行方差分析法，兩組比較行獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 S100A4基因和蛋白在乳腺組織中的表達水平比較 Western blot實驗結(jié)果顯示，S100A4蛋白在乳腺癌組織中表達明顯上調(diào)(表 1)；RT-PCR實驗結(jié)果顯示，S100A4基因在乳腺癌組織中表達明顯上調(diào)（表 2）。

表1 S100A4蛋白在乳腺癌組織及正常組織表達比較

2.2 S100A4基因和蛋白在轉(zhuǎn)染siRNA乳腺細胞中的表達水平比較 Western blot實驗分析顯示，乳腺癌細胞轉(zhuǎn)染siRNA后，S100A4蛋白表達水平下調(diào)(MCF-7 細胞：（104.1±11.36）vs（61.61±9.96）；MDA-MB-231 細胞：（185.23±10.54）vs（136.78±9.32)；RT-PCR實驗也顯示，乳腺癌細胞轉(zhuǎn)染siRNA后，S100A4基因表達水平降低(MCF-7 細胞：（31.87±0.15）vs（23.11±0.65）；MDA-MB-231 細胞：（26.61±0.03）vs（20.52±0.09）。

表2 S100A4基因在乳腺癌組織及正常組織表達比較

2.3 基因沉默組與陰性對照組EMT相關蛋白和基因表達水平比較 Western blot（表3）和 RT-PCR（表 4）實驗結(jié)果顯示，N-cadherin、Snail、Slug 蛋白和基因表達水平在基因沉默組明顯降低，而E-cadherin明顯上調(diào)。

3 討論

乳腺癌是發(fā)生于女性群體中最常見的惡性腫瘤之一。腫瘤侵襲至周圍組織和發(fā)生轉(zhuǎn)移是導致乳腺癌患者預后差的主要因素之一。有文獻報道，S100家族參與調(diào)節(jié)多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[10-11]。本實驗證明，S100家族的重要的成員之一S100A4在乳腺癌組織中的表達明顯上調(diào)，與Wang等[11]的報道一致。提示S100A4可能參與乳腺癌的生物學行為的調(diào)節(jié)。EMT參與結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。有文獻報道，S100A4參與調(diào)節(jié)人卵巢癌[12]、胰腺癌[13]、肝細胞肝癌[14]等的 EMT過程。EMT過程中，上皮細胞相關標志物E-cadherin明顯下調(diào)，間質(zhì)相關標志物N-cadherin明顯上調(diào)，Snail和Slug是參與調(diào)節(jié)EMT過程的重要的轉(zhuǎn)錄因子。本實驗結(jié)果顯示，沉默S100A4的乳腺癌細胞能上調(diào)E-cadherin表達水平，下調(diào)N-cadherin、Snail和Slug的表達，提示S100A4參與調(diào)節(jié)EMT過程。有文獻報道，敲低S100A4能抑制Src-FAK信號通路的激活[15]，此信號通路的激活能促進EMT[16-17]。Xu等[13]報道，S100A4通過調(diào)節(jié)Shh-Gli1信號通路，進而參與EMT的調(diào)節(jié)。故推測在人乳腺癌中，S100A4通過激活Src-FAK或者Shh-Gli1信號通路，進而激活EMT過程。Rudland等[18]報道，S100A4與乳腺癌患者的預后呈現(xiàn)負相關。本實驗證明，S100A4參與調(diào)節(jié)乳腺癌的EMT過程，而EMT是導致患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要機制之一，推測S100A4可能上調(diào)EMT過程，導致乳腺癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，進而影響患者的預后。

表3 沉默組與對照組EMT 相關蛋白表達水平比較（n=3）

表4 沉默組與對照組EMT 相關基因表達水平比較（n=3）

綜上所述，S100A4通過調(diào)節(jié)EMT過程，促進乳腺癌的侵襲和遷移，其可能成為乳腺癌治療新的靶標分子。