馬志超　江波　蔡志毅　陳武兵　李志海

[摘要] 目的 探討miR-155對喉鱗癌Hep-2細胞增殖與侵襲的影響。 方法 應(yīng)用LipofectamineTM2000將miR-155 inhibitor和miR-155陰性對照（NC）轉(zhuǎn)入Hep-2細胞，四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測細胞活力，Hoechst染色檢測細胞凋亡情況，Transwell實驗檢測細胞侵襲能力，Western blot檢測信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）和細胞因子信號抑制因子1（SOCS1）的表達水平。 結(jié)果 與miR-155 NC組比較，miR-155 inhibitor能顯著抑制腫瘤細胞增殖能力，提高腫瘤細胞凋亡率，降低細胞侵襲能力，并上調(diào)SOCS1，下調(diào)STAT3表達水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 miR-155可能通過SOCS1/STAT3信號通路促進Hep-2細胞增殖，抑制凋亡，并能提高細胞的侵襲能力，進而發(fā)揮致癌作用。

[關(guān)鍵詞] miR-155;喉鱗狀細胞癌;Hep-2細胞;細胞增殖;細胞侵襲

[中圖分類號] R739.65? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）11-0048-04

Effect of miR-155 on proliferation and invasion of laryngeal squamous cell carcinoma cell line Hep-2

MA Zhichao? ?JIANG Bo? ?CAI Zhiyi? ?CHEN Wubing? ?LI Zhihai

Department of Otolaryngology， Taizhou Municipal Hospital in Zhejiang Province， Taizhou? ?318000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of miR-155 on proliferation and invasion of laryngeal squamous cell carcinoma Hep-2 cells. Methods LipofectamineTM2000 was used to transfer miR-155 inhibitor and miR-155 negative control（NC） into Hep-2 cells. Cell viability was detected by MTT assay. Apoptosis was detected by Hoechst staining. Transwell assay was used to detect cell invasion ability. Signal transducers and activators of transcription 3（STAT3） and Suppressor of cytokine signaling 1（SOCS1） expression levels were detected by Western blot. Results Compared with miR-155 NC group， miR-155 inhibitor significantly inhibited the proliferation of tumor cells， increased the apoptosis rate of tumor cells， decreased the cell invasion ability， and up-regulated SOCS1 and down-regulated the expression of STAT3. The difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion MiR-155 may promote the proliferation of Hep-2 cells， inhibit apoptosisand increase the invasive ability of cells through SOCS1/STAT3 signaling pathway， thereby promoting carcinogenesis.

[Key words] miR-155; Laryngeal squamous cell carcinoma; Hep-2 cells; Cell proliferation; Cell invasion

喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是耳鼻喉科常見的原發(fā)惡性腫瘤之一，并且近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)為上升趨勢。雖然LSCC已形成以手術(shù)為主、放化療為輔的綜合治療模式，但晚期患者的5年生存率僅有51%[1-2]。因此從分子或基因水平研究LSCC相關(guān)機制及相關(guān)敏感基因以尋求基因靶點治療已成為研究重點。微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）是一種非編碼的RNA，長度約為21～25 bp。有研究指出，miRNA在惡性腫瘤發(fā)生進展中發(fā)揮重要作用[3-6]，miR-155是近年來發(fā)現(xiàn)的主要熱點“癌基因”之一，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在LSCC患者病變組織中miR-155較對照組表達明顯升高，并可以作為LSCC標(biāo)記物及預(yù)后的獨立因素。因此，本研究在此基礎(chǔ)上，通過降低LSCC細胞株Hep-2中miR-155的表達量，探討其對Hep-2細胞增殖、凋亡及侵襲的影響及可能機制，為LSCC的診治及基礎(chǔ)研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 主要材料

LSCC細胞株Hep-2（中國科學(xué)院細胞庫）;miR-155 inhibitor及miR-155 陰性對照（negative control，NC）（上海GenePharma公司）;LipofectamineTM2000、Trizol試劑（Invitrogen公司）;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone公司）;四甲基偶氮唑藍（MTT）法（美國Gibco公司）;Hoechst33258染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）;24孔Transwell板（美國Corning公司），基質(zhì)膠（美國BD公司）;兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase，GAPDH）單克隆抗體、細胞因子信號抑制因子1（Suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）及信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）（Abcam公司）。

1.2 實驗分組及細胞轉(zhuǎn)染

本實驗于2016年1月～2018年5月在浙江省臺州市耳鼻咽喉科基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用重點實驗室完成。實驗分組：（1）miR-155抑制物轉(zhuǎn)染組（miR-155 inhibitor組），轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor;（2）空白對照組（miR-155 NC組），轉(zhuǎn)染陰性對照核苷酸（miR-155 NC）;轉(zhuǎn)染按LipofectamineTM2000試劑說明書操作。

1.3 MTT法檢測細胞增殖能力

將轉(zhuǎn)染后的Hep-2細胞接種于96孔板，分別轉(zhuǎn)染12、24、36、48、60、72 h后加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)進行培養(yǎng)4 h，加入150 μL DMSO，震蕩后，應(yīng)用酶標(biāo)儀在560 nm波長下檢測各孔吸光度（A）值，實驗重復(fù)3次。

1.4 Hoechst染色

消化收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組Hep-2細胞接種于6孔板，加入固定液4%多聚甲醛（PFA），在避光條件下以Hoechst33258試劑進行染色，染色后進行觀察并拍照。

1.5 Transwell實驗

將預(yù)冷、無血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel基質(zhì)膠鋪在培養(yǎng)小室上;加入100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的各組轉(zhuǎn)染后Hep-2細胞（5×105個/mL）;于下室中加入含20%血清的DMEM培養(yǎng)液;37℃條件下培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)小室，用3.7%甲醇固定20 min，風(fēng)干，結(jié)晶紫染色10 min;流水沖洗，拭去上室底部未侵襲細胞;在100倍光學(xué)顯微鏡下進行觀察，每張膜隨機選取10個視野，計數(shù)每個視野的細胞數(shù)量。

1.6 Western blot

消化收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組Hep-2細胞接種于6孔板，提取細胞總蛋白，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜;一抗溶液（兔抗STAT3、SOCS1及GAPDH單克隆抗體）孵育，4℃過夜;次日在25℃條件下二抗溶液中孵育2 h;應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)顯色、曝光，經(jīng)ImageLab Software進行各抗體條帶灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 抑制miR-155表達對細胞增殖能力的影響

MTT實驗結(jié)果表明，與miR-155 NC組比較，下調(diào)miR-155表達量能明顯降低細胞增殖能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（封三圖5）。

2.2 抑制miR-155表達對細胞凋亡的影響

miR-155 NC組Hep-2細胞經(jīng)Hoechst33258染色后呈淡藍色熒光，細胞核大小較均一，圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻;miR-155 inhibitor組Hep-2出現(xiàn)較多的凋亡細胞，表現(xiàn)為亮藍色的核固縮和核碎裂呈分葉狀，其染色質(zhì)凝聚，呈顆粒團狀，分布不均勻。miR-155 inhibitor組可顯著增加細胞凋亡率（27.32±2.62）%，與miR-155 NC組（12.16±1.53）%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（封三圖6）。

2.3 抑制miR-155表達對細胞侵襲能力的影響

Transwell檢測顯示，miR-155 inhibitor組和miR-155 NC組的侵襲細胞數(shù)分別為（860±40）個、（1780±60）個，miR-155 inhibitor組細胞侵襲能力明顯低于miR-155 NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（封三圖7）。

2.4抑制miR-155表達對細胞SOCS1、STAT3蛋白表達的影響

Western blot實驗表明，抑制miR-155的表達引起SOCS1表達明顯上升，而STAT3的表達量明顯下降，結(jié)果有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）（表1、圖1）。

3 討論

miR-155作為miRNAs家族一員，是一種多功能microRNA，在細胞活動的重要環(huán)節(jié)，包括細胞增殖、分化、遷移、凋亡等生理過程中發(fā)揮著重要作用，通過介導(dǎo)Fox03a、RhoA等多種靶基因表達參與炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展[7-8]。已有研究表明miR-155在許多腫瘤組織中均存在異常表達，并發(fā)揮癌基因的作用。Peng等[9]發(fā)現(xiàn)miR-155可以通過抑制DMTF1促進膀胱癌的發(fā)生。Johansson等[10]在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，miR-155以TGF-β為靶分子，在上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移及侵襲過程中起重要作用;Huang等[11]研究表明，miR-155可以促進胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。但目前miR-155在LSCC發(fā)病中的具體作用機制研究仍相對較少。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)LSCC患者血漿中miR-155含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在LSCC患者病理組織中miR-155較對照組表達明顯升高，與其結(jié)果一致，并且發(fā)現(xiàn)miR-155可作為LSCC標(biāo)記物及預(yù)后的獨立因素。本研究在此基礎(chǔ)上，將miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染至喉癌Hep-2 細胞，下調(diào)miR-155的表達量，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的增殖能力明顯下降，而腫瘤凋亡明顯增加，細胞遷移侵襲能力減弱;而王洋等[13]通過miR-155模擬物轉(zhuǎn)染至Hep-2細胞中，上調(diào)miR-155的表達量，得到一致的結(jié)果，這些結(jié)果表明miR-155在LSCC的發(fā)生、發(fā)展的過程中起到原癌基因樣的作用。

但也有一部分研究結(jié)果得出相反的結(jié)論，認為miR-155對腫瘤的增殖、凋亡和侵襲等惡性特征起抑制作用。Lei等[14]發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細胞中，增加miR-155的表達量能降低腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，并且增加癌細胞對化療藥物的敏感性。Li等[15]的研究表明在MKN-45胃癌細胞中，過表達的miR-155靶向作用于信號傳導(dǎo)蛋白SMAD2抑制細胞的遷移、侵襲和粘附。這可能與miRNA的功能具有組織和細胞特異性有關(guān)，即在不同的組織細胞中miR-155通過調(diào)控不同的靶基因，激活不同的信號通路，從而發(fā)揮不同的功能。結(jié)合本研究的結(jié)果，提示miR-155在LSCC細胞Hep-2中是起到促進作用的，但其具體的調(diào)控機制仍有待進一步研究。

在眾多參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程的信號通路中，STAT3是其中重要的通路之一。其廣泛分布于不同的組織和細胞中?；罨蟮腟TAT3以二聚體形式進入細胞核，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其各種不同的生物學(xué)效應(yīng)[16-17]。Chang等[18]在結(jié)腸癌細胞中沉默STAT3表達，發(fā)現(xiàn)bcl-xl、survivin的表達顯著下降，從而促進結(jié)腸癌細胞的凋亡。Zhu等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制STAT3活性可明顯降低MMP-2的表達，使腫瘤侵襲性降低。最新研究表明miR-155是STAT3通路上游重要的調(diào)控基因，過度表達miR-155造成SOCS1的活性抑制，而SOCS1是STAT3的負性調(diào)控因子，SOCS1的抑制引起STAT3的過度激活，持續(xù)活化的STAT3促進腫瘤細胞的生長、增殖及侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor，下調(diào)miR-155后，發(fā)現(xiàn)喉癌Hep-2細胞中SOCS1的表達量增加，而STAT3的表達量下降，表明在喉鱗癌中miR-155可能通過調(diào)控SOCS1-STAT3通路來發(fā)揮癌基因的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)在CD4+PD-1+淋巴細胞中miR-155表達量明顯增高，而惡性腫瘤表面的程序性死亡因子配體1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）與CD4+PD-1+淋巴細胞結(jié)合后，誘導(dǎo)其向Tregs細胞轉(zhuǎn)化，而Tregs細胞是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答與免疫耐受平衡的重要效應(yīng)細胞，過多的Tregs細胞引起腫瘤免疫逃逸的發(fā)生;而miR-155通過抑制SOCS1，激活STAT3的信號通路，在維持Tregs細胞增殖活性及功能上具有重要作用[21-24]。本研究觀察到miR-155通過SOCS1- STAT3通路影響Hep-2細胞的生物學(xué)活性，提示miR-155可能與LSCC腫瘤免疫逃逸過程相關(guān)，為下一步的研究提供重要方向。

綜上所述，本研究表明轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor能顯著抑制Hep-2細胞增殖能力，提高腫瘤細胞凋亡率，降低細胞侵襲能力，其機制可能與SOCS1/STAT3信號通路相關(guān)。

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（收稿日期：2018-09-25）