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(1.長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022；2.興安盟農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400；3.中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130102;4.科爾沁右翼前旗農(nóng)牧業(yè)和科學(xué)技術(shù)局農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 科右前旗 137423)

0 引 言

在石油開(kāi)采、貯運(yùn)及使用過(guò)程中，操作不當(dāng)會(huì)引起石油泄漏，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞，甚至威脅人類健康[1]。由石油所引起污染的問(wèn)題已經(jīng)越來(lái)越廣泛被當(dāng)今國(guó)際社會(huì)所關(guān)注。2011年6月，中國(guó)蓬萊19-3油田溢油事故造成海洋及土壤大面積污染，水體、土壤結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致動(dòng)植物生存受到威脅[2]；2017年1月，印度恩諾爾港口附近兩艘油輪相撞，約392.8 t重質(zhì)原油泄漏，破壞了海洋生態(tài)，并嚴(yán)重影響了海洋生物的生存[3]。中國(guó)作為世界第五大石油開(kāi)采國(guó)，由石油所引起的污染問(wèn)題亟待解決[4]。吉林省西部莫莫格濕地地下蘊(yùn)藏著豐富的石油資源，該濕地內(nèi)吉林油田英臺(tái)采油廠所設(shè)立的400多口采油井在使用及操作過(guò)程中對(duì)濕地土壤造成了嚴(yán)重污染，致使優(yōu)勢(shì)植物苔草、小葉章大面積退化，棲息鳥(niǎo)類數(shù)量減少[5]。

當(dāng)石油污染程度超過(guò)濕地生態(tài)系統(tǒng)的自我修復(fù)能力，那么緩慢的修復(fù)過(guò)程將再一次受到阻礙。在石油污染治理的探索過(guò)程中，Oh等[6]利用超聲波法去除淤泥中的多環(huán)芳烴；于一雷等[7]利用植物原位修復(fù)的方法，通過(guò)種植堿蓬治理被石油污染的土壤；Tian等[8]利用凝膠珠與根系復(fù)合作用去除土壤中的多環(huán)芳烴。但物理修復(fù)與化學(xué)修復(fù)方法由于前期投入大、復(fù)合材料回收難等問(wèn)題，在實(shí)際修復(fù)過(guò)程中難以應(yīng)用。生物修復(fù)是利用生物自凈功能與強(qiáng)化生物凈化功能對(duì)污染場(chǎng)地中的污染物進(jìn)行降解的過(guò)程，具有成本低，操作簡(jiǎn)便，不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在菌株篩選上做了大量工作，許多細(xì)菌、真菌及藻類都有降解多環(huán)芳烴的能力[11]，常見(jiàn)的微生物有假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和微球菌屬(Micrococcus)等[12-13]。莫莫格濕地石油污染區(qū)的土壤往往具有鹽堿化特征，通常情況下環(huán)境因子(包括鹽濃度、pH、溫度及污染物濃度等)對(duì)微生物的代謝活動(dòng)和生理功能影響較大，因此明確菌株對(duì)不同環(huán)境影響因子的響應(yīng)是利用該菌株對(duì)石油烴污染進(jìn)行生物修復(fù)的必要前提[14]。

本研究以石油中重要組分之一的多環(huán)芳烴—菲(Phenanthrene，Phe)為唯一碳源，輔以鹽堿脅迫條件[15]，從莫莫格濕地石油污染土壤中篩選分離出一株在鹽堿環(huán)境下對(duì)Phe具有降解能力的鹽單胞菌(Holomonas)S1-8菌株，并對(duì)篩選的Holomonassp.S1-8菌株進(jìn)行降解條件優(yōu)化及降解能力測(cè)定，探討其在鹽堿脅迫下的降解動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果表明菌株S1-8對(duì)鹽堿環(huán)境具有良好的適應(yīng)性，在生物修復(fù)被石油污染的鹽堿土壤中具有潛在的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)

本研究中土壤樣本來(lái)源于吉林油田分公司英臺(tái)采油廠，位于莫莫格國(guó)家自然保護(hù)區(qū)境內(nèi)，地處嫩江、洮兒河和呼爾達(dá)河交叉地帶。莫莫格國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(45°42′25″～46°18′0″N，123°27′0″～124°4′33″E)位于吉林省西部，總面積14.4萬(wàn)hm2，其中濕地面積占全區(qū)總面積的80%以上，莫莫格濕地是我國(guó)重要的候鳥(niǎo)繁殖地與跨國(guó)遷徙鳥(niǎo)類的停歇地，是我國(guó)主要的鹽堿土地分布地之一。

1.2 采樣點(diǎn)設(shè)置及樣品采集

在莫莫格濕地內(nèi)吉林油田主要產(chǎn)油區(qū)(該區(qū)為石油污染較為嚴(yán)重的區(qū)域)隨機(jī)設(shè)置一個(gè)采樣點(diǎn)(45°55′N，123°55′E)。在采樣點(diǎn)，去除土壤表面雜物后采集0～20 cm深度土壤樣本，將土樣裝入無(wú)菌密封袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

試劑盒：Axygen細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒、Axygen PCR試劑盒(康寧生命科學(xué)有限公司)和菲(分析純AR，上海麥克林生化科技有限公司)。

磷酸鹽緩沖液：pH 7.2、NaCl (8.0 g·L-1)、KCl (0.2 g·L-1)、Na2HPO4(3.4 g·L-1)和KH2PO4(0.2 g·L-1)。

LB培養(yǎng)基：NaCl(10.0 g·L-1)、胰蛋白胨(10.0 g·L-1)和酵母提取物(5.0 g·L-1)(Oxoid， Thermo Fisher Scientific)。

無(wú)機(jī)礦物鹽培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O (17.9 g·L-1)、NaH2PO4·2H2O (7.8 g·L-1)、(NH4)2SO4(5.0 g·L-1)、KCl (5.0 g·L-1)、ZnSO4·7H2O(0.1 g·L-1)、MnCl2·4H2O(0.03 g·L-1)、CoCl2·6H2O(0.2 g·L-1)、CuCl2·2H2O(0.01 g·L-1)、NiCl2·6H2O(0.02 g·L-1)、NaMoO4·2H2O(0.03 g·L-1)、FeSO4·7H2O(0.2 g·L-1)和H3BO3(0.3 g·L-1)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

Agilent氣相色譜(6890)-質(zhì)譜(7000)聯(lián)用儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 土壤理化性質(zhì)。土樣風(fēng)干后過(guò)2 mm篩子備用。土壤pH用pH計(jì)法[16]；土壤Na+采用火焰光度法測(cè)定。

1.4.2 菌株的篩選。取10 g新鮮土壤樣本，90 mL無(wú)菌生理鹽水，置于滅菌三角瓶?jī)?nèi)，在搖床中30 ℃ 170 rpm震蕩15 min后，靜置，取1 mL上清液加入到20 mL以Phe為唯一碳源且含5% NaCl、pH 8.0的無(wú)機(jī)礦物培養(yǎng)基中，170 rpm，30 ℃培養(yǎng)7 d，篩選出能夠降解Phe的耐鹽堿菌株。

1.4.3 菌株鑒定及菌懸液制備。在LB固體培養(yǎng)基上稀釋涂平板并劃線與細(xì)菌掃描電鏡樣品的制備[17]。

1.4.4 菌株分子生物學(xué)鑒定。PCR擴(kuò)增菲降解菌株16S rRNA基因及其PCR產(chǎn)物測(cè)序分析。菲降解菌株DNA擴(kuò)增通用引物為p27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和p1492r (5′-ACGGHTACCTTGTTTACGA-CTT-3′)，在包含2 μL 2×Eassy Taq PCR SuperMix (TransGen Biotech 2×Easy Taq PCR SuperMix，CA)、2 μL PCR引物(27F and 1492R)及1 μL DNA 模板的50 μL PCR反應(yīng)體系中，采用細(xì)菌PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增(預(yù)變性：94 ℃下5 min；該擴(kuò)增程序進(jìn)行30次循環(huán)：變性94 ℃下45 s，退火55 ℃下45 s，延伸72 ℃下60 s；最終延伸：72 ℃下10 min，4 ℃下保溫，終止流程)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將純化后的PCR產(chǎn)物使用Sanger測(cè)序法進(jìn)行雙端測(cè)序(上海生工生物技術(shù)有限公司)。測(cè)序結(jié)果與GenBank中已有的16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比對(duì)。

1.4.5 不同培養(yǎng)條件下菌株對(duì)Phe的降解效率研究。下列所有實(shí)驗(yàn)中菌懸液的制備按照此標(biāo)準(zhǔn)：在無(wú)菌條件下將篩選得到的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體，并用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)洗滌3次，經(jīng)無(wú)機(jī)礦物鹽培養(yǎng)基重懸后，將菌懸液調(diào)至所需濃度備用。

不同取樣時(shí)間和鹽濃度條件下菲降解菌株對(duì)Phe的降解效率及其降解動(dòng)力學(xué)研究。由于篩選菌株的土樣Na+含量較高，本研究中設(shè)置7個(gè)不同鹽濃度(0、2%、5%、10%、15%、20%和30%的NaCl)培養(yǎng)條件，研究菲降解菌對(duì)Phe的降解能力。按5%的接種量接種到20 mL初始添加濃度為50 mg·L-1Phe的無(wú)機(jī)礦物鹽培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中菌液初始添加濃度OD600為0.2，分別在不同鹽濃度條件下30 ℃震蕩培養(yǎng)15 d；在培養(yǎng)1 d、3 d、5 d、7 d、10 d和15 d時(shí)，檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)液中Phe的殘留量，最終計(jì)算出菲降解菌在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Phe的降解率；根據(jù)Phe降解率研究其在不同鹽濃度條件下的降解動(dòng)力學(xué)。本研究中降解實(shí)驗(yàn)均設(shè)立3組平行。

不同pH條件下菲降解菌對(duì)Phe的降解效率。利用HCl或NaOH調(diào)節(jié)最適生長(zhǎng)的鹽濃度培養(yǎng)液的pH，在6個(gè)不同pH梯度(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0)且Phe的初始添加濃度為50 mg·L-1的無(wú)機(jī)礦物鹽培養(yǎng)基中接入菌液，使細(xì)菌初始添加濃度OD600為0.2，30 ℃震蕩培養(yǎng)15 d，研究菲降解菌在不同pH條件下對(duì)Phe的降解能力。

不同溫度條件下菲降解菌對(duì)Phe的降解效率。在最適生長(zhǎng)的鹽濃度和pH的無(wú)機(jī)礦物鹽培養(yǎng)液中接入菌液，使培養(yǎng)基中細(xì)菌初始添加濃度OD600為0.2，在5個(gè)不同溫度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃)且Phe的初始添加濃度為50 mg·L-1條件下，震蕩培養(yǎng)15 d，研究菲降解菌在不同培養(yǎng)溫度條件下對(duì)Phe的降解能力。

不同Phe初始濃度條件下菲降解菌對(duì)Phe的降解效率。確定最適生長(zhǎng)的鹽濃度、pH和溫度的條件下，在5個(gè)不同Phe初始添加濃度(25、50、100、150和200 mg·L-1)的無(wú)機(jī)礦物鹽培養(yǎng)液中接入菌液，使培養(yǎng)基中菌液初始添加終濃度OD600為0.2，30 ℃震蕩培養(yǎng)15 d，研究菲降解菌在Phe不同初始添加濃度條件下對(duì)Phe的降解能力。

1.4.6 溶液中Phe的提取與定量分析。殘留Phe的提取。將培養(yǎng)基全部轉(zhuǎn)入分液漏斗后，用10 mL正己烷分3次清洗三角瓶并將正己烷全部轉(zhuǎn)至分液漏斗中，將分液漏斗置于分液漏斗振蕩器上，270 rpm充分震蕩10 min，靜置，將培養(yǎng)基中剩余Phe萃取至有機(jī)相中，收集有機(jī)相。取有機(jī)相溶液過(guò)0.22 μm尼龍濾膜，將濾液用色譜純正己烷稀釋10倍，待測(cè)。

GC-MS檢測(cè)。配制Phe濃度分別為1 mg·L-1、3 mg·L-1、5 mg·L-1、7 mg·L-1、10 mg·L-1和15 mg·L-1的正己烷標(biāo)準(zhǔn)樣品，利用Agilent氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，設(shè)置樣品檢測(cè)條件后進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度與積分峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。

在動(dòng)力學(xué)的研究中，生物降解的過(guò)程是單反應(yīng)物反應(yīng)體系，故選擇一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行降解動(dòng)力學(xué)的研究[19]。研究表明，微生物降解動(dòng)力學(xué)可以用Logistic模型、零級(jí)及一級(jí)反應(yīng)模型等多種模型來(lái)描述，當(dāng)污染物初始濃度較高時(shí)，一級(jí)反應(yīng)模型能夠較好的模擬微生物降解動(dòng)力學(xué)過(guò)程[20]。在Phe作為唯一碳源的無(wú)機(jī)礦物鹽培養(yǎng)基中，菲降解菌生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)NaCl濃度的敏感影響著一系列的反應(yīng)，本研究采用Langmuir-Hinshelwoood模型來(lái)描述在不同鹽濃度條件下S1-8降解Phe的動(dòng)力學(xué)。一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程為：

lnC=-kt+lnC0

式中：k表示一級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)(d-1)；C為t(d)時(shí)刻Phe濃度(mg·L-1)；C0為初始Phe濃度(mg·L-1)。

1.4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。將16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建菲降解菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。用Microsoft Excel 2010版繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算Phe降解率。用Origin 8.0軟件繪制Phe降解率曲線并研究Phe降解動(dòng)力學(xué)模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐鹽堿Phe降解菌株的分離、篩選與鑒定結(jié)果

本研究采集土壤樣本的pH為8.51，Na+含量為21.3 g·kg-1。利用Phe為唯一碳源，輔以鹽堿脅迫對(duì)土壤樣品中的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，并對(duì)富集的微生物進(jìn)行分離和純化，最終篩選到一株耐鹽堿的菲降解細(xì)菌，命名為S1-8。圖1為菌株S1-8在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(圖1a)及掃描電鏡照片(圖1b)。結(jié)果表明：菌落形態(tài)為圓形，表面光滑且邊緣整齊，微微凸起(圖1a)；細(xì)菌呈桿狀且表面光滑(圖1b)。

圖1 鹽單胞菌S1-8在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖(a)和掃描電鏡圖片(b)Fig.1 Morphological properties of Halomonas sp.S1-8 by the observation of LB agar plate (a) and scanning electron microscopy(b)

經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得菌株S1-8 16S rRNA基因片段，約為1 500 bp。將獲得的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示S1-8與Halomonasvariabilis(HTG7AY204638.1)的相似度最高(99%)，表明該菌為Halomonas菌屬。選取12株Halomonas代表菌株作為參考菌株，采用鄰接法構(gòu)建S1-8的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)并分析其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，明確該菌株屬于鹽單胞菌屬(Halomonas)，故將其命名為Halomonassp.S1-8 (NCBI注冊(cè)號(hào)為MK326897)。

圖2 利用鄰接法構(gòu)建菌株S1-8的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of the S1-8 strain constructed by Neighbor-joining method

2.2 菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化及降解能力測(cè)定

2.2.1 鹽濃度對(duì)菌株S1-8降解Phe效率的影響。如圖3所示，S1-8在Phe降解過(guò)程中，NaCl濃度顯著影響其對(duì)Phe的降解過(guò)程。當(dāng)NaCl濃度低于5%時(shí)， Phe的降解率與鹽濃度呈正相關(guān)關(guān)系，隨著鹽度的升高，各個(gè)時(shí)期Phe的降解速率增加，降解率增大，同時(shí)結(jié)果表明在鹽濃度為5%的條件下培養(yǎng)15 d后，Phe的降解率最高，達(dá)到74%；當(dāng)鹽濃度高于5%，隨著鹽濃度由10%增加至30%，S1-8各個(gè)時(shí)期的降解率明顯下降，菌株的降解效果隨著鹽度的增加受到了明顯的抑制，在鹽度為30%條件下，Phe的降解率降低至41%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株S1-8對(duì)鹽濃度具有較廣的適應(yīng)范圍，并在試驗(yàn)鹽濃度條件下均可有效發(fā)揮其對(duì)Phe的降解功能，但降解能力受鹽度高低的影響。周海燕[21]在研究中發(fā)現(xiàn)，嗜鹽菌株TSL5-1、TSL5-2耐鹽范圍較廣，在0.5%～19.5%鹽度范圍內(nèi)均對(duì)芘具有降解能力，但其最適降解鹽度僅為3%～5%，且微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中，通常對(duì)鹽的耐受性不高，鹽濃度較低時(shí)，微生物生長(zhǎng)速率與鹽濃度呈正相關(guān)關(guān)系，但當(dāng)鹽濃度超過(guò)一定限度，微生物生長(zhǎng)則變得較為緩慢，甚至死亡。苗朝華[22]在研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)鹽度適應(yīng)范圍較廣的中度嗜鹽菌黃河鹽單胞菌，能夠在鹽含量為0.5%～25%的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并對(duì)其復(fù)雜的鹽適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行探究。張海榮等[23]在石油污染鹽堿土壤中篩選得到10株耐鹽堿石油烴降解菌，菌株對(duì)鹽濃度的耐受濃度均在5%左右，當(dāng)鹽濃度高于11%時(shí)菌株的生長(zhǎng)活性呈下降趨勢(shì)，因此過(guò)高的鹽濃度對(duì)菌株的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。在鹽單胞菌的研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)該種屬細(xì)菌的不同菌株對(duì)鹽濃度具有較廣的適應(yīng)范圍，在適宜的鹽度范圍內(nèi)，鹽度對(duì)其生理代謝功能影響較小，超過(guò)最適鹽度，其生理活性會(huì)隨著鹽度的增加而降低。

2.2.2 pH對(duì)菌株S1-8降解Phe效率的影響。pH是微生物生長(zhǎng)代謝的主要影響因素之一，環(huán)境pH對(duì)微生物的生物活性有很大的影響，同時(shí)微生物對(duì)pH適應(yīng)范圍廣，在一定程度上說(shuō)明微生物對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)[24]。因此，研究菌株最適生長(zhǎng)的pH在微生物生長(zhǎng)代謝中至關(guān)重要。李丹丹等[25]在莫莫格石油污染土壤中分離出的假單胞菌，在偏酸性pH 6.5時(shí)對(duì)石油烴降解率最高。從圖4中可以看出，S1-8 在無(wú)機(jī)礦物鹽培養(yǎng)基的pH為6.0～11.0時(shí)均具有對(duì)Phe的降解能力。pH為6.0時(shí)，培養(yǎng)15 d后Phe的降解率達(dá)到55%，隨著pH增加，菌株S1-8對(duì)Phe的降解率也在增加，直至pH達(dá)到8.0時(shí)，菌株15 d內(nèi)對(duì)Phe的降解率達(dá)到峰值，約為74%。隨著pH的繼續(xù)提高， S1-8對(duì)Phe的降解能力顯著下降，但當(dāng)pH達(dá)到10.0以上時(shí)，pH對(duì)菌株降解Phe能力的影響差異不顯著。上述結(jié)果說(shuō)明菌株S1-8具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力且在弱堿性環(huán)境中可獲得對(duì)Phe的最高降解率，但在弱酸和強(qiáng)堿環(huán)境中S1-8對(duì)Phe的降解率相對(duì)較低。

注：溫度:30 ℃；Phe初始濃度:50 mg·L-1；pH 8.0；菌液初始添加OD600=0.2。Note:Temperature: 30 ℃;Initial concentrations of Phe:50 mg·L-1;pH 8.0;OD600=0.2.圖3 S1-8在不同鹽濃度下各時(shí)間點(diǎn)對(duì)Phe的降解效率Fig.3 Degradation efficiency of S1-8 for Phe at different incubation time under different salt concentrations

注：溫度：30 ℃；Phe初始濃度：50 mg·L-1；鹽濃度：5%；菌液初始添加OD600=0.2。Note:Temperature: 30 ℃;Initial concentrations of Phe:50 mg·L-1;Salt concentration: 5%;OD600=0.2.圖4 S1-8在不同pH條件下培養(yǎng)15 d后對(duì)Phe的降解效率Fig.4 Degradation efficiency of S1-8 for Phe after incubation for 15 days under different pH

2.2.3 溫度對(duì)菌株S1-8降解Phe效率的影響。溫度也是影響微生物活性的重要因素之一，Phe的降解效果間接地受到了溫度的影響[26]。本研究中，S1-8菌株在鹽濃度為5%，pH為8.0的條件下，選擇15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃這5個(gè)溫度條件培養(yǎng)15 d后，結(jié)果如圖5所示，S1-8能夠在溫度為15 ℃～35 ℃環(huán)境中生長(zhǎng)，尤其是在30 ℃培養(yǎng)條件下，Phe最終降解率約為74%；該菌株在常溫條件下篩選分離獲得，在15 ℃和20 ℃時(shí)，由于培養(yǎng)溫度較低，菌株的降解能力并不突出，可能該菌株對(duì)低溫較為敏感，對(duì)降解率的影響較大；當(dāng)在25 ℃和35 ℃溫度條件下培養(yǎng)15 d，降解效率分別達(dá)到51%和48%，說(shuō)明在25 ℃～35 ℃為菌株適宜生長(zhǎng)的溫度區(qū)間，在該溫度區(qū)間下S1-8對(duì)Phe的降解能力較高。

注： Phe初始濃度：50 mg·L-1；pH 8.0；鹽濃度：5%；菌液初始添加OD600=0.2。Note:Initial concentrations of Phe: 50 mg·L-1;pH 8.0; Salt concentration: 5%; OD600=0.2.圖5 S1-8在不同溫度下培養(yǎng)15 d對(duì)Phe的降解效率Fig.5 Degradation efficiency of S1-8 for Phe after incubation for 15 days under different temperature

2.2.4 Phe初始濃度對(duì)菌株S1-8降解Phe效率的影響。不同Phe初始濃度對(duì)微生物降解Phe的效率影響很大。當(dāng)Phe初始濃度較低時(shí)，有利于微生物對(duì)多環(huán)芳烴的降解；而當(dāng)Phe初始濃度較高時(shí)，微生物對(duì)多環(huán)芳烴的降解能力降低，高濃度的Phe使細(xì)胞代謝受到抑制，對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，從而降低了微生物對(duì)Phe的降解能力。當(dāng)Phe初始添加量為25 mg·L-1、50 mg·L-1時(shí)，由于低濃度的Phe對(duì)菌株無(wú)明顯的抑制效果，菌株可以較好地發(fā)揮降解功能，其降解效率較高。隨著Phe初始添加量增加至100 mg·L-1，Phe對(duì)菌株的脅迫增強(qiáng)，Phe的降解率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；當(dāng)Phe初始濃度增加至150～200 mg·L-1時(shí)，高濃度的Phe對(duì)菌體抑制更加嚴(yán)重，降解率進(jìn)一步降低。隨著Phe初始濃度的提高其降解率由最高74%降至7%。這和宋立超[27]的研究結(jié)果具有一致性，即在Phe初始濃度達(dá)到75 mg·L-1時(shí)降解率急劇下降。由此可見(jiàn)，底物濃度過(guò)高會(huì)對(duì)微生物降解Phe產(chǎn)生阻礙作用。一方面，由于Phe具有較強(qiáng)的疏水作用，高濃度Phe不利于微生物對(duì)溶解氧的獲取，影響微生物對(duì)Phe的代謝作用；另一面，高濃度Phe及其中間代謝產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)微生物可產(chǎn)生一定的毒害作用。因此，盡管菌株S1-8對(duì)Phe具有一定的濃度耐受性，但其耐受程度是有限的，而事實(shí)上，除了Phe泄露區(qū)或石油泄漏核心區(qū)，很少有環(huán)境中有極高濃度的Phe存在，因此，大多數(shù)的菲降解菌仍可發(fā)揮其功能。

2.3 不同鹽濃度條件下菌株S1-8的降解動(dòng)力學(xué)

在pH 8.0的堿性環(huán)境中，輔以不同鹽濃度脅迫，菌株S1-8對(duì)Phe的降解擬合線性圖如圖7所示，由圖可看到擬合的一級(jí)降解模型較好，可以很好地反映菌株在不同鹽濃度條件下的降解能力。由表1擬合參數(shù)可知，在20%、30%高鹽濃度條件下，由于微生物對(duì)Phe的利用受到抑制，使S1-8對(duì)Phe的降解率顯著降低，在這兩個(gè)鹽濃度條件下R2較低；其余5個(gè)鹽濃度條件下的R2均在0.92之上，說(shuō)明該方程可較好地?cái)M合菌株S1-8在不同鹽濃度條件下的對(duì)Phe的降解過(guò)程，為菌株S1-8生物降解Phe的工程化應(yīng)用等方面的研究起到重要的指導(dǎo)作用。

注：溫度：30 ℃；鹽濃度：5%；pH 8.0；菌液初始添加OD600=0.2。Note: Temperature: 30 ℃; Salt concentration: 5%;pH 8.0; OD600=0.2.圖6 S1-8在不同Phe初始濃度條件下培養(yǎng)15 d對(duì)Phe的降解效率Fig.6 Degradation efficiency of S1-8 for Phe after incubation for 15 days under different initial concentrations of Phe

圖7 菌株S1-8降解Phe的準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合曲線Fig.7 Curves of the first-order kinetics of Phe biodegradation by strain S1-8

鹽濃度NaCl/%判斷系數(shù)Adj.R-Square速率常數(shù)k標(biāo)準(zhǔn)誤差SE殘差平方和Residual sun of squares標(biāo)準(zhǔn)均方誤差SD00.950 70.062 20.005 80.028 00.005 620.968 10.086 40.006 40.034 40.006 950.983 70.091 80.004 80.019 50.003 9100.986 00.045 70.002 20.004 20.000 8150.920 20.046 80.005 60.026 30.005 3200.784 50.039 70.008 30.058 10.011 6300.826 80.039 20.007 20.043 70.008 7

3 結(jié) 論

本研究中耐鹽堿Phe降解菌篩選分離自莫莫格濕地被石油污染的土壤，確定該石油烴降解菌為鹽單胞菌，將其命名為Halomonassp.S1-8。菌株S1-8對(duì)鹽濃度及環(huán)境酸堿度具有較廣的適應(yīng)范圍，分別為鹽度0～30%和pH 6.0～11.0。在初始鹽濃度為5% ，pH為8.0，培養(yǎng)溫度為30℃條件下，菌株S1-8對(duì)Phe的降解達(dá)到較為理想的效果，且該降解過(guò)程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。菌株S1-8最適生長(zhǎng)的鹽濃度及酸堿環(huán)境均接近于莫莫格濕地石油污染土壤的化學(xué)指標(biāo)，將該地區(qū)土壤中篩選分離獲得的土著菌株應(yīng)用于石油污染土壤的原位修復(fù)，亦能夠更好地發(fā)揮菌株對(duì)石油污染物的降解特性。Halomonassp.S1-8是一株性能優(yōu)良的可用于莫莫格濕地石油污染土壤修復(fù)的土著菌株。