魏 娜，張飛龍

(西藏農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測研究所， 西藏 拉薩 850032)

黃曲霉毒素主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的代謝產(chǎn)物，毒性是氰化鉀的 10 倍，是人類癌癥的一個重要的致癌源，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)定為Ⅰ類致癌物[1]。黃曲霉毒素廣泛存在于糧油農(nóng)產(chǎn)品及其制品中，至今已分離出的黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，而黃曲霉毒素M1作為其中的一種，主要存在于牛乳中[2-3]。 西藏酥油是從高原地區(qū)牦牛牛奶中提煉出來的油脂產(chǎn)品，是西藏高原地區(qū)牧民攝入脂肪的主要膳食途徑之一[4-5]。酥油主要含有脂肪、水分及少量蛋白質(zhì)，其中水分含量高達15 %左右，豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和較高的水分含量為微生物的滋生與繁殖創(chuàng)造了非 常適宜的環(huán)境條件，若儲藏條件不佳，便會導(dǎo)致酥油中霉菌的大量繁殖，產(chǎn)生真菌毒素，嚴重影響酥油品質(zhì)及其安全性[6]。劉曉棠、達娃卓瑪、王秋玲等對西藏酥油中微生物的污染進行了評價，發(fā)現(xiàn)西藏地區(qū)酥油樣品霉菌檢出率為90 %以上[7-9]。由于儀器設(shè)備及檢測技術(shù)的限制，目前鮮有對西藏酥油中真菌毒素含量研究報道。黃曲霉毒素最常用的檢測方法是高效液相色譜分析法，雖然精確度高，但設(shè)備昂貴、操作繁瑣、耗時長、檢測成本高。時間分辨免疫熒光免疫層析(time-resolved fluorescence immunochromatography，TRFIA)，是近些年來得到發(fā)展應(yīng)用的一種免疫分析技術(shù)，具有靈敏度高、檢測速度快、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，該技術(shù)目前已在食品安全檢測領(lǐng)域得到應(yīng)用[10-14]。因此本研究采用時間分辨熒光免疫分析儀測定酥油中黃曲霉毒素M1含量，以期為西藏酥油產(chǎn)品的質(zhì)量安全、科學監(jiān)管與防控提供重要檢測手段。

表1 酥油樣品中精密度與加標回收率

1 材料與方法

1.1 檢測原理

采用競爭免疫層析原理定量檢測乳制品中黃曲霉毒素M1含量：在檢測試紙條上固化了黃曲霉毒素M1抗原和質(zhì)控抗體；在凍干品中包含有時間分辨熒光素標記的黃曲霉毒素M1抗體和質(zhì)控抗原，當在凍干品中加入含有黃曲霉毒素M1的樣品后，時間分辨熒光素標記的黃曲霉毒素M1抗體發(fā)生化學反應(yīng)生成復(fù)合物，插入試紙條后，該復(fù)合物會隨樣品層析到T檢測區(qū)域而不與T線的抗原結(jié)合，樣品黃曲霉毒素M1含量越高，T區(qū)域結(jié)合越弱。凍干品中的質(zhì)控抗原與C線位置的質(zhì)控抗體直接結(jié)合。

1.2 儀器

時間分辨熒光免疫分析儀、K30加熱器、高效液相色譜儀。

1.3 檢測方法

前處理。稱取1～2 g樣品(精確到0.001 g，被稱試樣中含黃曲霉毒素AFM1<8 ng)于50 mL離心管，加入8 mL石油醚，待酥油溶解后加入9 mL水和11 mL甲醇，振蕩30 min，將全部液體移至分液漏斗中。加入0.3 g氯化鈉搖動溶解，靜置分層后，將下層轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL以下，用PBS稀釋至30 mL。

時間分辨熒光免疫層析法。將待測樣品及檢測試紙、凍干品回復(fù)至室溫。打開樣品杯，加入150 μl待測樣品，充分溶解、混勻，置加熱器37 ℃溫育，取出檢測試紙條，插入加熱器上的樣品杯中，孵育6 min后，取出試紙條吸干下端液體，3 min內(nèi)放入時間分辨熒光免疫分析儀中讀取結(jié)果，當 AFM1含量過高，超出檢測卡的檢測范圍(2.0 μg/kg)時，需將樣品進行一定比例稀釋后進行檢測。

免疫親和柱凈化-HPLC法。按照《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素M族的測定》(GB 5009.24-2016)第二法 高效液相色譜法測定。C18色譜柱(4.6 mm×150 mm ×5 μm)；進樣量50 μl；柱溫40 ℃；流動相為乙腈-甲醇(1∶1)和水，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min；熒光檢測器激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的準確度和精密度

根據(jù)黃曲霉毒素定量檢測卡的定量范圍0～2.0 μg/kg，分別添加 AFM1標準溶液于陰性酥油樣品中，使其在樣品中的最終含量為 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/kg，并進行5次重復(fù)試驗。表1可知，該方法測定不同樣品中AFM1的回收率在 77.6 %～89.6 %之間，樣品的重復(fù)測定結(jié)果RSD為6.12 %～14.06 %。說明該檢測技術(shù)具有較好的準確度和精密度。

2.2 黃曲霉毒素時間分辨熒光免疫層析檢測實際樣品與HPLC檢測結(jié)果比對

選取5份酥油樣品，分別采用時間分辨熒光免疫分析法和《食品安全國家標準.食品中黃曲霉毒素M族的測定》(GB 5009.24-2016，第二法 高效液相色譜法)進行比對，進一步考察驗證方法的科學性和適用性。由表2可知，時間分辨熒光免疫分析法與免疫親和柱凈化-HPLC法測定結(jié)果的相對誤差小于10 %，能滿足酥油產(chǎn)品中黃曲霉毒素M1快速篩查的測定準確度的要求。與國標方法免疫親和柱凈化-HPLC法相比，該方法具有操作簡便、時間短、靈敏度高、不用接觸毒素標準品、有機試劑用量少、對環(huán)境及檢驗人員安全性最高等優(yōu)點，適用于企業(yè)和質(zhì)檢機構(gòu)對糧油農(nóng)產(chǎn)品中 AFM1進行現(xiàn)場篩查。

3 結(jié) 論

本文利用高效液相色譜法和時間分辨熒光免疫層析法進行酥油中黃曲霉毒M1檢測的對比研究。采用時間分辨熒光免疫層析法檢測其回收率為77.6 %～89.6 %，變異系數(shù)為6.12 %～14.05 %，與 HPLC法相比，檢測結(jié)果無顯著性差異，相對誤差小于12 %。時間分辨熒光免疫層析法檢測過程中避免使用黃曲霉毒素標準品，可以直接讀取檢測結(jié)果，且所需時間短，檢測全過程控制10 min內(nèi)，儀器便于攜帶，可實現(xiàn)在農(nóng)貿(mào)市場和超市等現(xiàn)場實地的快速檢測，為酥油樣品中黃曲霉毒素的快速檢測提供了一種新的模式。

表2 時間分辨熒光免疫層析法與高效液相色譜法檢測結(jié)果比較