羅翠松 林 云 曾志峰 將星星 時(shí) 軍

肝激酶B1(LKB1)是1種腫瘤抑制基因，廣泛表達(dá)于人體內(nèi)的各種組織器官中，是AMPK的上游激酶，在LKBl/AMPK通路激活及下游通路的調(diào)節(jié)等方面扮演著重要角色，研究表明，LKB1表達(dá)異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)[1-3]，但有關(guān)LKB1蛋白在合并2型糖尿病的肝癌組織中的表達(dá)情況未見報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫組化發(fā)檢測合并2型糖尿病患者肝癌組織中LKB1蛋白的表達(dá)，以探討LKB1蛋白表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2007年1月至2013年3在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院期間行肝癌切除、病案資料齊全且合并2型糖尿病的乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌組織標(biāo)本共計(jì)60例，其中，男性52例，女性8例；年齡35～78歲，中位年齡56歲。20例正常肝組織標(biāo)本來源于同期因外傷性肝破裂住院手術(shù)患者的標(biāo)本。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：①肝癌的首次治療為接受肝癌根治性切除術(shù)；②2型糖尿?。虎鄹喂δ蹸hild-Pugh評(píng)分A級(jí)或B級(jí)；④年齡在30～80歲；⑤術(shù)后病理診斷為肝細(xì)胞癌；⑥乙肝表面抗原陽性，丙肝抗體陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受過經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、經(jīng)皮肝臟局部消融治療、放射治療或其他全身性的抗腫瘤治療；②合并門靜脈主干及一級(jí)分支、總肝管及一級(jí)分支、肝靜脈主干及下腔靜脈癌栓；③有肝外轉(zhuǎn)移的肝癌；④同期罹患其他器官惡性腫瘤或其他嚴(yán)重疾??；⑤肝癌破裂。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)和隨訪方法

HCC和DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)分別符合原發(fā)性肝癌診療規(guī)范[4]和1999年世界衛(wèi)生組織WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；肝細(xì)胞癌和肝硬化的診斷均由術(shù)后病理證實(shí)；結(jié)合影像學(xué)檢查，將重度肝硬化定義為：肝臟形態(tài)比較規(guī)則，邊緣呈小結(jié)節(jié)狀和(或)輕度波浪狀，質(zhì)地不均勻、呈彌漫顆粒狀，肝葉比例基本正常，肝裂正?；蛟鰧抂6]；肝癌復(fù)發(fā)包括肝內(nèi)和肝外復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)定義為：CT或MRI發(fā)現(xiàn)的肝內(nèi)外新發(fā)病灶，或者甲胎蛋白水平持續(xù)性升高?；颊叱鲈汉竺?個(gè)月隨訪一次，隨訪截止時(shí)間為2014年7月30日。

1.4 主要試劑

濃縮型鼠抗人LKB1單克隆抗體，工作濃度1∶150，購自STATA CRUZ公司。S-P免疫組化染色超敏試劑盒(A:內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑；B:正常非免疫動(dòng)物血清；C:生物素標(biāo)記的第二抗體；D:鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶)，購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。磷酸鹽緩沖液PBS (0.01M,pH7.2)、檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(0.01M,pH6.0)和DAB顯色試劑盒，購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.5 結(jié)果判定

以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知的陽性肝癌標(biāo)本作為陽性對(duì)照。結(jié)果判斷以細(xì)胞質(zhì)或伴細(xì)胞核著色為陽性，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例及細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量。染色分級(jí)：整張切片無陽性細(xì)胞(-)，陽性細(xì)胞<10%(+)，陽性細(xì)胞10%～50%(++)，陽性細(xì)胞>50%(+++)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)把(-)和(+)記為陰性，把(++)和(+++)記為陽性。由2位高年資病理醫(yī)生在不知患者臨床和病理資料情況下，依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)免疫組化染色結(jié)果分別進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)和范圍表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(百分比)表示，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)；用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，兩組間差異用Log-rank檢驗(yàn)比較，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型模型進(jìn)行單因素和多因素分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LKB1蛋白在正常肝組織和合并糖尿病肝癌組織中的表達(dá)

在所測60例組織中，LKB1蛋白陽性表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)中。正常肝組織和肝癌組織中LKB1蛋白的陽性表達(dá)率分別為100.0%(20/20)和41.7%(25/60)；肝癌組織中LKB1蛋白的陽性表達(dá)率明顯低于正常肝組織，兩組比較有顯著性差異(χ2=20.74，P=0.00)。

2.2 LKBl蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

由表1可知，LKB1蛋白的表達(dá)與肝癌患者的肝硬化狀態(tài)有關(guān)，合并肝硬化或重癥肝硬化的HCC患者肝癌組織中的LKB1蛋白陽性表達(dá)率明顯低于未合并肝硬化或重癥肝硬化的肝癌組織(χ2=5.50，P=0.02；χ2=4.07，P=0.04)；LKB1蛋白的表達(dá)與性別、年齡、甲胎蛋白、血紅蛋白、血小板、凝血酶原時(shí)間、白蛋白、總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、病理分級(jí)、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量、腫瘤包膜無關(guān)(P>0.05)。

2.3 LKB1蛋白表達(dá)與肝硬化程度相關(guān)性分析

經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，LKB1蛋白陽性表達(dá)與肝硬化和重度肝硬化均呈負(fù)相關(guān)性(γ=-0.30，P=0.02；γ=-0.26，P=0.04)。

2.4 LKBl蛋白表達(dá)與糖尿病相關(guān)因素的關(guān)系

由表2可知，LKB1蛋白表達(dá)與肝癌患者的糖尿病病程長短(χ2=4.21，P=0.04)和空腹血糖水平(χ2=6.86，P=0.01)有關(guān)，糖尿病病程大于5年和高血糖組的HCC患者肝癌組織中的LKB1蛋白陽性表達(dá)率更低； LKB1蛋白表達(dá)與體重指數(shù)無關(guān)(χ2=0.01，P=0.93)。

2.5 LKB1蛋白表達(dá)與合并2型糖尿病肝癌預(yù)后的關(guān)系

本組患者1、3、5年總體生存率為84.8%、72.6%、54.1%，LKB1蛋白陰性表達(dá)組與LKB1蛋白陽性表達(dá)組的中位生存時(shí)間分別是48個(gè)月和73個(gè)月，LKB1蛋白陰性表達(dá)組的生存時(shí)間顯著低于LKB1蛋白陽性表達(dá)組，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，組間比較差異有顯著性(χ2=6.26，P=0.01，圖1)。

表1 合并糖尿病肝癌組織中LKB1表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

表2 合并2型糖尿病肝癌組織中LKB1表達(dá)與糖尿病相關(guān)因素的關(guān)系(例，%)

2.6 合并2型糖尿病肝癌患者預(yù)后因素分析

單因素分析發(fā)現(xiàn)(表3)，重度肝硬化、腫瘤數(shù)量、復(fù)發(fā)后治療、LKB1蛋白陽性表達(dá)是影響HCC患者術(shù)后生存率的重要預(yù)后因素。將單因素分析中影響患者總體生存率的重度肝硬化、腫瘤數(shù)量、復(fù)發(fā)后治療、LKB1蛋白陽性表達(dá)等4個(gè)因素引入Cox回歸模型做多因素分析發(fā)現(xiàn)，LKB1蛋白陽性表達(dá)、復(fù)發(fā)后治療、腫瘤數(shù)量、重度肝硬化分別為影響肝癌患者術(shù)后生存率的獨(dú)立預(yù)后因素，見表4。

圖1 LKB1蛋白陰性表達(dá)組和LKB1蛋白陽性表達(dá)組總體生存時(shí)間比較

表3 影響肝癌患者術(shù)后OS危險(xiǎn)因素的單因素分析

表4 影響肝癌患者術(shù)后OS的多因素分析

3 討論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病標(biāo)化率雖呈下降趨勢，但仍處于高發(fā)狀態(tài)[7]，受人口老齡化、代謝性疾病和不健康生活方式等因素的影響，合并2型糖尿病的肝癌患者正在增多，其死亡率時(shí)期效應(yīng)仍呈上升趨勢[8]，對(duì)合并2型糖尿病肝癌的研究正在提上日程。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)[9]，合并2型糖尿病肝癌多見于有慢性乙型肝炎病史、糖尿病病程較長、超重或肥胖的男性肝硬化患者，且預(yù)后差于非糖尿病肝癌患者。糖代謝紊亂是合并2型糖尿病肝癌主要特點(diǎn)之一，而作為AMPK的上游激酶，在能量代謝和抑制腫瘤生長均有重要作用的LKB1，在血糖代謝紊亂和慢性乙型肝炎長期并存的肝癌組織中的表達(dá)情況及其對(duì)合并2型糖尿病肝癌患者預(yù)后的影響并未見報(bào)道。

研究發(fā)現(xiàn)，LKB1在胃癌[10]、結(jié)腸癌[11]、宮頸癌[12]和肺癌組織[13]中均表現(xiàn)為低表達(dá)，本研究也得到了相同的結(jié)果，合并2型糖尿病肝癌組織LKB1蛋白的陽性表達(dá)率明顯低于正常肝組織(41.7%vs 100%)，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究認(rèn)為，抑癌基因LKB1突變與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，卵巢癌[14]、肝癌[15]中均發(fā)現(xiàn)了LKB1 基因突變，Lu等[16]認(rèn)為LKB1基因突變使其蛋白激酶活性和細(xì)胞生長調(diào)控功能喪失，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，而LKB1蛋白的低表達(dá)作為LKB1基因突變后在蛋白水平上的表現(xiàn)，提示了LKB1蛋白的低表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，LKB1蛋白的表達(dá)與肝癌患者的肝硬化狀態(tài)有關(guān)，肝硬化程度越重，LKB1蛋白陽性表達(dá)率越低，兩者呈負(fù)相關(guān)性；另外，在空腹血糖高于正常水平和糖尿病病程超過5年的患者中，其LKB1蛋白陽性表達(dá)率要低于正?？崭寡墙M和糖尿病病程小于5年的肝癌組，這提示患者的肝硬化程度和長期的血糖代謝紊亂狀態(tài)對(duì)LKB1蛋白的表達(dá)存在一定的影響， LKB1的低表達(dá)可能降低了肝癌患者的預(yù)后，本研究結(jié)果也顯示， LKBl蛋白陰性表達(dá)組的中位生存時(shí)間明顯低于陽性表達(dá)組，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，差異有顯著性，Cox回歸多因素分析發(fā)現(xiàn)：LKB1蛋白的陽性表達(dá)是肝癌預(yù)后的保護(hù)因素。

總之，本研究結(jié)果表明，在合并2型糖尿病肝癌組織，LKB1蛋白陽性表達(dá)率低，LKB1蛋白表達(dá)下調(diào)與肝硬化、空腹血糖和糖尿病病程相關(guān)，LKB1蛋白低表達(dá)是合并2型糖尿病肝癌患者的不良預(yù)后因素之一。