張伯瑞 薛崇祥 何世勇 肖楠 田源 郁萬(wàn)剛 陶方

【摘 要】目的：研究藥食兩用3號(hào)方對(duì)熱證痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用。方法：將32只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、秋水仙堿組和復(fù)方干預(yù)組，每組8只。除空白對(duì)照組外，其余各組均通過(guò)注射尿酸鈉造成大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，并置于高溫環(huán)境下制成熱證模型，用秋水仙堿和痛風(fēng)藥食兩用3號(hào)方分別對(duì)秋水仙堿組和復(fù)方干預(yù)組大鼠灌胃給藥。檢測(cè)踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)增加百分比，末次給藥后腹主動(dòng)脈采血，檢測(cè)大鼠血清中αN乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、超氧化物歧化酶、尿酸、腫瘤壞死因子-α的水平。結(jié)果：與模型對(duì)照組比較，復(fù)方干預(yù)組踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)增加百分比、αN乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、尿酸、腫瘤壞死因子-α均明顯降低，超氧化物歧化酶明顯升高（P < 0.01）。結(jié)論：藥食兩用3號(hào)方對(duì)熱證痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠有降尿酸、抗炎抗氧化的作用。其作用機(jī)制可能與降低超氧化物歧化酶活性，抑制腫瘤壞死因子-α、αN乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶合成與釋放有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎;熱證型;藥食兩用3號(hào)方;抗炎;抗氧化;大鼠

據(jù)痛風(fēng)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)痛風(fēng)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的代謝類疾病[1]。痛風(fēng)的中醫(yī)病機(jī)為先天稟賦不足，后天嗜食膏粱厚味加之外邪襲入皮肉筋脈[2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)是以嘌呤代謝紊亂為主要病因，由尿酸鹽晶體沉積引發(fā)的非感染性疾病。其臨床特點(diǎn)為高尿酸血癥以及尿酸鹽沉積所致的反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)炎和軟組織損傷。目前，西藥改善急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀效果顯著，但是伴隨著較大的不良反應(yīng)[3]。中醫(yī)藥治療痛風(fēng)具有不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，而藥食兩用方更兼?zhèn)浞奖恪⒖砷L(zhǎng)期服用等特點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)[4]。藥食兩用3號(hào)方是根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部頒布的《既是食品又是藥品的物品名單》擬定，所選藥物兼具藥用和食用兩種特性，主要用于治療熱證型痛風(fēng)。本實(shí)驗(yàn)建立熱證痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，以αN乙酰氨基葡萄糖苷酶（αNAG）、β-半乳糖苷酶（β-gal）、超氧化物歧化酶（SOD）、尿酸（UA）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等為指標(biāo)，觀察藥食兩用方對(duì)熱證痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的緩解程度，為痛風(fēng)藥食兩用方的研制提供客觀理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠（清潔級(jí)）32只，體質(zhì)量（200±20）g。由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（遼）2013-0003。大鼠飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，按晝夜節(jié)律自然照明，室溫為20～22 ℃，空氣濕度保持在50%～60%，自由攝食飲水。

1.2 藥物與試劑 痛風(fēng)藥食兩用3號(hào)方由金銀花、當(dāng)歸、甘草、葛根、馬齒莧、薏苡仁、枳椇子、茯苓組成，經(jīng)大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院中藥方劑學(xué)教研室張琳副教授鑒定。水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)Q/12HB4218-2009）;吐溫80（北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)301C052）;尿酸鈉（上海晶都生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)BCBS7438）;秋水仙堿（北京盛世康普化工技術(shù)研究所，生產(chǎn)批號(hào)Q-006-150731）;αNAG、β-gal、UA、SOD、TNF-α檢測(cè)試劑盒（南京森貝伽生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)分別為180327R0945、180327R0941、180327R0944、180327R0008、180327R0040）。

1.3 儀 器 電子天平（奧豪斯儀器有限公司，型號(hào)PX423ZH）;冷凝回流裝置、圓底燒瓶、電熱套（上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，型號(hào)DZTW）;Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德祥科技有限公司，型號(hào)Value）;超速離心機(jī)、-80 ℃冰箱[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，型號(hào)分別為Sorvall WX系列、Forma 88000];酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司，型號(hào)SpectraMax iD5）。

2 方 法

2.1 痛風(fēng)藥食兩用3號(hào)方的制備 將金銀花20 g、當(dāng)歸20 g、甘草10 g、葛根10 g、馬齒莧10 g、薏苡仁10 g、枳椇子10 g、茯苓10 g置于圓底燒瓶中，加7倍量雙蒸水，加熱回流提取2次，每次2 h，合并提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮至45 mL。

2.2 動(dòng)物分組 將32只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、秋水仙堿組和復(fù)方干預(yù)組，每組8只。

2.3 造模方法 將模型對(duì)照組、秋水仙堿組、復(fù)方干預(yù)組大鼠置于（37±2）℃的高溫環(huán)境，每日1次，每次1 h，持續(xù)半個(gè)月，造成熱證大鼠模型[5]。第7天，空白對(duì)照組注射生理鹽水，其余各組大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔麻醉后，于右足踝關(guān)節(jié)內(nèi)注射尿酸鈉溶液（25 g·L-1）0.2 mL，以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為準(zhǔn)，復(fù)制大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型[6]。

2.4 給藥方法 造模后24 h，秋水仙堿組大鼠予秋水仙堿1.5 mg·kg-1·d-1灌胃，每日1次;復(fù)方干預(yù)組大鼠予痛風(fēng)藥食兩用3號(hào)方22 g·kg-1·d-1灌胃，每日2次;空白對(duì)照組、模型對(duì)照組大鼠予生理鹽水10 mL·kg-1·d-1灌胃，每日2次。連續(xù)給藥7 d。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)方法 于造模后0，24，48，72，96，120，144，168 h等8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用無(wú)彈性棉線和四用不銹鋼帶表卡尺測(cè)量各組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)的周長(zhǎng)值，計(jì)算并記錄踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)增加百分比，計(jì)算公式：周長(zhǎng)增加百分比=（測(cè)定時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)周徑-初始周徑）/初始周徑×100%。末次給藥后，各組大鼠腹主動(dòng)脈取血清，采用酶聯(lián)免疫法對(duì)血清中αNAG、β-gal、SOD、UA、TNF-α含量進(jìn)行檢測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在酶標(biāo)包被板上加標(biāo)準(zhǔn)品，待測(cè)樣品孔中先添加稀釋液，再加待測(cè)樣品，封板后置37 ℃溫浴30 min。稀釋，洗滌后每孔加酶標(biāo)試劑辣根過(guò)氧化物酶在37 ℃下溫浴30 min，加入底物后37 ℃避光保存15 min，加入終止液使反應(yīng)終止，測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)增加百分比比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)增加百分比均顯著增加（P < 0.01），于24 h左右達(dá)到高峰;與模型對(duì)照組比較，復(fù)方干預(yù)組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)增加百分比均降低（P < 0.01）;與秋水仙堿組比較，復(fù)方干預(yù)組大鼠在120 h、144 h，踝周長(zhǎng)增加百分比明顯降低（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

3.2 各組大鼠血清中αNAG、β-gal、SOD、UA和TNF-α含量比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中αNAG、β-gal、UA、TNF-α含量顯著增加，SOD含量顯著降低（P < 0.01）;與模型對(duì)照組比較，秋水仙堿組和復(fù)方干預(yù)組大鼠血清中αNAG、β-gal、UA、TNF-α含量顯著降低，SOD含量顯著增加（P < 0.01），且復(fù)方干預(yù)組變化更顯著（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)表2。

4 討 論

個(gè)體差異以及所感外邪種類的不同，決定了所患痛風(fēng)的性質(zhì)不同。痛風(fēng)主要包括風(fēng)濕蘊(yùn)熱證、痰瘀痹阻證和久痹正虛證[7]。風(fēng)濕蘊(yùn)熱證為痛風(fēng)發(fā)作早期最常見(jiàn)的證型[8]，在這里筆者不是應(yīng)用一般的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，而是主動(dòng)建立熱證痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，更符合人類痛風(fēng)的發(fā)病規(guī)律，能更有針對(duì)性地研究此藥方對(duì)熱證型痛風(fēng)即痛風(fēng)早期階段的作用。痛風(fēng)發(fā)作是在血液中尿酸含量超過(guò)其物理溶解度，以單鈉尿酸鹽晶體的形式析出基礎(chǔ)上發(fā)生的，尿酸鹽晶體與局部微環(huán)境相互作用主要通過(guò)巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生以白細(xì)胞介素-1（IL-1）為主，還包括IL-8、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子又可以引起中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤(rùn)，產(chǎn)生更加廣泛的炎癥反應(yīng)[9]。氧自由基主要來(lái)源于尿酸鹽晶體引起的免疫炎癥反應(yīng)的過(guò)程，氧自由基可以在巨噬細(xì)胞內(nèi)激活細(xì)胞因子的表達(dá)[10]，大量產(chǎn)生的氧自由基需要SOD等抗氧化酶進(jìn)行對(duì)抗，這就造成了SOD的減少[11]，所以本實(shí)驗(yàn)選取SOD作為一個(gè)表現(xiàn)炎癥反應(yīng)程度的敏感指標(biāo)。αNAG和β-gal同屬細(xì)胞溶酶體內(nèi)的水解酶，可間接反映痛風(fēng)的程度，其主要來(lái)源于腎小管上皮細(xì)胞，當(dāng)腎小管受到損傷時(shí)會(huì)釋放到血液中，引起其濃度升高[12]。血液中高濃度的尿酸會(huì)沉積于腎臟形成尿酸鹽結(jié)晶，這些結(jié)晶造成周圍單核細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞壞死。所以利用αNAG和β-gal可反映痛風(fēng)的嚴(yán)重程度。TNF-α可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在痛風(fēng)局部炎癥中起重要作用[13]。筆者在前期設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)參考了多篇文獻(xiàn)，均通過(guò)測(cè)定大鼠關(guān)節(jié)腫脹度以及αNAG、β-GAL、SOD、UA、TNF-α等5種指標(biāo)來(lái)衡量痛風(fēng)造模是否成功和藥物對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的效果[14-16];因此，選用大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及以上指標(biāo)作為最終的檢測(cè)指標(biāo)，病理學(xué)研究?jī)?nèi)容將在后期相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)一起展示。

痛風(fēng)藥食兩用3號(hào)方是針對(duì)熱證痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病因病機(jī)，以清熱利濕、健脾除痹為治則而制定。方中金銀花、當(dāng)歸為君藥，葛根、馬齒莧、枳椇子為臣藥，薏苡仁、茯苓、甘草為佐藥。全方以清熱除濕、調(diào)和陰陽(yáng)功效為主，另兼補(bǔ)脾益胃，以期達(dá)到緩解炎癥、止痛清熱的效果?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，金銀花中的有機(jī)酸類化合物綠原酸具有抗菌、抗炎、抗氧化等作用[17];當(dāng)歸的有效成分阿魏酸具有清除氧自由基的作用[18];甘草可以選擇性地抑制與花生四烯酸發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)的代謝酶活性，使前列腺素、白三烯等炎性介質(zhì)無(wú)法產(chǎn)生，抑制前列腺素的合成與釋放，從而發(fā)揮抗炎作用[19];葛根可有效清除機(jī)體內(nèi)源性抗脂質(zhì)過(guò)氧化物及氧自由基物質(zhì)[20];枳椇子有抗氧化作用[21]。

本實(shí)驗(yàn)采用ELISA檢測(cè)方法，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），說(shuō)明造模是成功的。與模型對(duì)照組比較，秋水仙堿組、復(fù)方干預(yù)組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度下降（P < 0.01），αNAG、β-gal、UA、TNF-α含量均顯著降低，SOD含量顯著增加（P < 0.01），但復(fù)方干預(yù)組變化更顯著。說(shuō)明痛風(fēng)藥食兩用3號(hào)方對(duì)熱證痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用主要為減輕踝關(guān)節(jié)的紅腫熱痛癥狀，起效快，作用強(qiáng)，同時(shí)具有降UA作用，標(biāo)本兼顧。該方治療熱證痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的療效優(yōu)于秋水仙堿，而且避免了秋水仙堿引起的皮膚黏膜損害，泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)功能影響等不良反應(yīng)[22];同時(shí)，藥食兩用方調(diào)配方便、針對(duì)性強(qiáng)，既保持了中醫(yī)湯劑辨證論治、療效顯著的特色，又克服了傳統(tǒng)湯劑煎煮繁瑣、攜帶不便等缺點(diǎn)，與現(xiàn)代生活節(jié)奏加快的發(fā)展趨勢(shì)相適應(yīng)，可長(zhǎng)期服用，緩緩調(diào)治，與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的反復(fù)發(fā)作、無(wú)法治愈的特點(diǎn)相吻合，為其治療提供了新的方法和思路。

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收稿日期：2018-09-02;修回日期：2019-03-11