王研，李衛(wèi)東，魏建平，馬毅兵，曹忠良，林黎娟，張錦輝

（1.遼東學院醫(yī)學院 分子醫(yī)學研究室，遼寧 丹東 118003；丹東市第一醫(yī)院 2.麻醉科，3.普外科，遼寧 丹東 118001；丹東市中心醫(yī)院4.病理科，5.胸外科，遼寧 丹東 118002）

胃腺癌（ gastric adenocarcinoma，GAC）是一種常見的惡性腫瘤，手術(shù)切除是目前最有效的治療方法。臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、病理分級、有無血管及漿膜侵犯是重要的預后因素[1]。雖然有許多相關(guān)的分子學研究，但是多種基因的表達方式及其在GAC演進中所起的作用仍不清楚[2-3]。探討GAC預后和靶向治療的生物標志物很有必要，IMP3蛋白是胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA結(jié)合蛋白家族的成員之一，與該家族其他成員，如IMP2、IMP3等，在胚胎早期中的RNA運輸及穩(wěn)定、細胞生長及遷移中起重要調(diào)控作用[4]。研究表明，IMP3在結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、膠質(zhì)瘤及甲狀腺癌等惡性腫瘤中呈高表達[5-9]，并與腫瘤細胞遷移、侵襲及淋巴浸潤和遠處轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為密切相關(guān)，可幫助臨床診斷高風險性病例、指導治療及評價預后[10]。目前，國內(nèi)關(guān)于IMP3與GAC關(guān)系的報道較少，研究IMP3蛋白與GAC發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，對判斷GAC預后、早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶和提供新的治療靶點具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2007年2月—2011年2月在丹東市第一醫(yī)院行手術(shù)切除的92例GAC患者的組織蠟塊標本。其中，男性60例，女性32例；年齡22～79歲，平均49.5歲。術(shù)后經(jīng)蘇木精-伊紅染色法（HE）證實為GAC，其中高分化30例，中等分化46例，低分化16例；腫塊≤3 cm 50例，＞3 cm 42例；伴有淋巴結(jié)58例，侵及漿膜34例；臨床分期Ⅰ、Ⅱ期72例，Ⅲ、Ⅳ期20例。所有患者術(shù)前未行放化療，另將92例癌旁正常胃黏膜組織和16例有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織納入本實驗。

1.2 SP法染色

組織芯片脫蠟、水化，檸檬酸鹽抗原修復液中修復，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗，置入30 ml/L過氧化氫H2O2中10 min，正常血清37℃孵育15 min，加入一抗（1∶50稀釋，鼠抗人IMP3多克隆抗體和鼠抗人Ki-67單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司），空白對照中以PBS代替一抗，4℃冰箱孵育過夜，加入二抗，37℃孵育60 min，DAB顯色，HE復染，中性樹膠封固[9]。IMP3蛋白為胞漿著色，Ki-67蛋白為細胞核著色。IMP3結(jié)果判斷標準：無表達為陰性（-）；著色細胞數(shù)＜50%或染色較淺為弱陽性（+）；著色細胞數(shù)＞50%且染色較深為強陽性（++）。Ki-67結(jié)果判斷標準：著色細胞數(shù)＜5%為陰性；著色細胞數(shù)＞5%為陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件和Graphpad Prism 6.0繪圖軟件，計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，IMP3在不同類型胃組織中的表達用校正檢驗水準法進行進一步的兩兩比較，檢驗水準α=0.0125；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，影響因素分析用Cox回歸模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 IMP3蛋白陽性表達率與胃組織類型的關(guān)系

胃組織中癌旁組織、GAC和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的IMP3蛋白表達陽性率、強陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=14.500和4.143，P=0.000和0.001）。GAC、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中IMP3蛋白陽性、強陽性表達率高于癌旁組織（P＜0.05）；轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中IMP3蛋白強陽性表達率高于GAC組織（P＜0.05）。IMP3陽性著色在細胞漿或細胞膜。見表1和圖1。

表1 不同組織類型的IMP3蛋白表達陽性率及強陽性率比較

圖1 IMP3蛋白在GAC及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達 （SP×100）

2.2 IMP3高表達與GAC臨床病理特征的關(guān)系

GAC組織中IMP3的高表達率與Ki-67表達、臨床分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否有漿膜侵犯有關(guān)（P＜0.05）；與性別、年齡、腫瘤大小和組織分化程度無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

2.3 IMP3蛋白高表達對GAC生存率的影響

IMP3蛋白高表達的GAC患者無瘤生存率及5年生存率均低于低表達的患者（χ2=15.281和17.545，均P=0.000），說明IMP3蛋白對患者的預后有影響。見圖2。

2.4 IMP3蛋白高表達與GAC患者預后的關(guān)系

利用單因素Cox回歸模型分析所有GAC患者的臨床參數(shù)，結(jié)果顯示腫瘤大小、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有漿膜侵犯、臨床分期及IMP3高表達與患者總生存率相關(guān)（P＜0.05）。再將這些參數(shù)進行多因素分析得出，漿膜侵犯、臨床分期高IMP3蛋白高表達是GAC患者預后不良的獨立危險因素（P＜0.05），表明IMP3高表達可以做為GAC潛在的標志物。見表3、4。

表2 不同臨床病理特征患者IMP3蛋白高表達率比較

圖2 兩組患者的無瘤生存率及5年生存率比較

表3 GAC患者預后因素的單因素Cox回歸模型參數(shù)

表4 GAC患者預后因素的多因素Cox回歸模型參數(shù)

3 討論

IMP3基因定位于7p11.5，其高度保守區(qū)包括KH區(qū)和RRM區(qū)。其中C端包括4個KH區(qū)，N端包括2個RRM區(qū)。IMP3的轉(zhuǎn)錄物含有4 158 bp，包括250 bp的5'-非翻譯區(qū)，1 740個bp的開放讀碼框架，2 168 bp的3'非翻譯區(qū)。3'-UTRs的AU富含區(qū)包含8個AUUUA和4個AUUUUUA重復序列[4]。AUUUA序列和IMP3轉(zhuǎn)錄物的翻轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)有關(guān)，該區(qū)的轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定并且會快速降解，會導致其蛋白合成降低[3，6]。

研究顯示，IMP3在多種惡性腫瘤中是預測不良結(jié)局的分子標志物，如MIZUKAMI等[11]用半定量免疫組織化學方法檢測20例20HLA-A2402陽性的食鱗狀細胞癌組織中的IMP3表達，結(jié)果顯示14例呈強表達，6例呈弱表達，且與組織病理分級相關(guān)；同時由酶聯(lián)斑點實驗檢測到該20例患者中有8例腫瘤浸潤的淋巴細胞存在T細胞介導的IMP3特異性抗原，IMP3可能是潛在的免疫治療靶點。YUAN等[12]用免疫組織化學方法檢測186例原發(fā)單灶的結(jié)直腸癌中IMP3的表達，約1/3出現(xiàn)IMP3高表達，高分級和IMP3高表達的患者生存率低于無IMP3高表達的患者，IMP3高表達在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中與其侵襲性相關(guān)，是結(jié)直腸癌預后的重要標志；多變量分析也顯示IMP3高表達與漿膜浸潤、臨床分期一樣是影響預后的獨立因素，IMP3是結(jié)直腸癌特別是高分級結(jié)直腸癌潛在的有效治療靶點。還有研究利用RNAi干擾HA22T細胞IMP3的表達，導致細胞遷移、侵襲及上皮細胞的移行能力下降，但發(fā)現(xiàn)IMP3沉默后并未導致細胞偽足結(jié)構(gòu)的減少，因此并不認同該基因卷入細胞遷移是由于偽足形成[13]。之后的微陣列芯片分析顯示[14]，IMP3低表達與導致腫瘤侵犯的80多種基因下調(diào)有關(guān)聯(lián)，其中包括47種已知基因，而且大部分是屬于同一家族基因（如KLRC、CXCL、表皮生長因子等）。有10種基因參與細胞的遷移和侵襲，IMP3去除后最主要的上調(diào)基因是E-cadherin，通過PCR驗證與微陳列芯片的結(jié)果一致，說明IMP3在腫瘤細胞的黏附、遷移及侵襲中起關(guān)鍵的調(diào)控作用，可以用來評估腫瘤患者的預后。

筆者的前期研究結(jié)果也表明，IMP3高表達預示非小細胞肺癌和原發(fā)肝細胞癌患者預后不良[3，15]。本研究結(jié)果顯示GAC組織、轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中IMP3陽性表達率均高于癌旁組織，而轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中表達又高于癌組織；GAC組織中IMP3陽性表達率與Ki-67表達、是否有淋巴轉(zhuǎn)移及是否侵犯漿膜層密切相關(guān)；伴有IMP3高表達的GAC患者無瘤生存率和5年生存率高于低表達的患者，且漿膜侵犯、高臨床分期IMP3高表達是胃腺癌患者預后不良的獨立危險因素。

Ki-67是廣泛應用于惡性腫瘤細胞增殖的指標，與生長分數(shù)相關(guān)。以往研究表明，Ki-67與惡性腫瘤的不良預后有關(guān)[13]。本研究中IMP3的表達與Ki-67有關(guān)，表明IMP3陽性表達情況與細胞的增殖程度有關(guān)，可能兩者共同促進GAC進展。

綜上所述，筆者認為檢測GAC中IMP3蛋白的表達水平可以作為判斷臨床預后的指標之一，有助于提高對患者臨床、病理診斷的準確性，為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。