朱永娜，陳直，宋偉，張曉東

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 口腔科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000）

慢性根尖肉芽腫是一種以炎性骨吸收為特征的常見(jiàn)疾病[1]。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）對(duì)該病有重要的調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟，調(diào)節(jié)骨吸收[2-4]。白介素-34（Interleukin-34，IL-34）是一種新型炎癥因子，該因子的表達(dá)受TNF-α的調(diào)節(jié)[5-6]。TNF-α和IL-34均可以調(diào)節(jié)慢性根尖肉芽腫中的骨吸收[7-8]，但慢性根尖肉芽腫中IL-34與TNF-α的關(guān)系還不清楚。因此本研究擬初步探討慢性根尖肉芽腫中兩者表達(dá)的相關(guān)性，以進(jìn)一步研究TNF-α的致病機(jī)制，為后期臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月—2018年5月就診于蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬且醫(yī)院臨床及影像學(xué)診斷為慢性根尖肉芽腫的患者，收集患牙拔除時(shí)的病損軟組織13例作為實(shí)驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者近2個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用抗生素及非甾體類(lèi)藥物；②患者無(wú)高血壓、糖尿病等系統(tǒng)性疾病，無(wú)其他口腔疾病；③患者的患牙無(wú)牙髓活力，無(wú)法保留，需要拔除；④X射線診斷患牙為慢性根尖肉芽腫；⑤患者無(wú)拔牙禁忌證。另選取本院同期就診拔除阻生牙時(shí)切除的健康牙齦組織8例作為對(duì)照組（符合納入標(biāo)準(zhǔn)中的①②⑤）。

1.2 方法

1.2.1 蘇木精-伊紅（HE）染色將收集的軟組織用去離子水沖洗3 min，置于4%的甲醛中固定24 h，石蠟包埋備用。將石蠟切成4μm厚的連續(xù)切片，然后按HE步驟進(jìn)行染色。封片后，倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果，判定標(biāo)本類(lèi)型。根尖肉芽腫的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)為：可見(jiàn)以大量炎癥細(xì)胞、毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞增生為主的炎癥肉芽組織。篩選影像學(xué)和病理診斷一致并且符合要求的標(biāo)本，最終獲得實(shí)驗(yàn)組9例。

1.2.2 鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接（streptavidin-perosidase，SP）法將符合要求的石蠟包塊切成4μm厚切片。切片脫蠟、復(fù)水及抗原修復(fù)。用3%過(guò)氧化氫液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶。滴加一抗50μl于4℃避光過(guò)夜孵育（IL-34抗體和TNF-α分別用抗原稀釋液1∶100和1∶500稀釋?zhuān)?。每張切片滴加兔抗人二?0μl孵育20 min，加入二氨基聯(lián)苯胺顯色液在顯微鏡下觀察，至染色效果理想時(shí)終止染色。蘇木精復(fù)染3 min。切片脫水、透明，每步之間均要用磷酸鹽緩沖液充分洗滌切片。中性膠封片后在倒置顯微鏡下拍照觀察。陰性對(duì)照為肉芽腫組織，用磷酸鹽緩沖液代替一抗孵育切片作為陰性對(duì)照組。

陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上出現(xiàn)黃色或棕色顆粒。每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野拍照，并用Image-J軟件進(jìn)行分析。

1.3 影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)

患牙根尖、根側(cè)方或根分叉處有直徑＜1 cm的低密度影像，并且邊界清晰，周?chē)琴|(zhì)正?；蛘呱晕⒆冎旅躘9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組病理檢查結(jié)果比較

慢性根尖肉芽腫中見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞等，并伴有新生血管形成（見(jiàn)圖1A）。健康牙齦見(jiàn)大量纖維組織，炎癥細(xì)胞較少（見(jiàn)圖1B）。

圖1 兩組患者病理切片圖 （HE×20）

2.2 各組TNF-α、IL-34相對(duì)表達(dá)量比較

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組可見(jiàn)TNF-α表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞漿及細(xì)胞核上。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組TNF-α相對(duì)表達(dá)量分別為（0.246±0.059）和（0.158±0.017），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.274，P=0.002），實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組（見(jiàn)圖2）。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組可見(jiàn)IL-34表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組IL-34相對(duì)表達(dá)量分別為（0.206±0.038）和（0.131±0.023），經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.867，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組中IL-34表達(dá)較高（見(jiàn)圖3）。陰性對(duì)照組中兩者均無(wú)表達(dá)。

圖2 各組TNF-α的表達(dá) （SP法×40）

圖3 各組IL-34的表達(dá) （SP法×40）

2.3 IL-34和TNF-α表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組TNF-α與IL-34呈正相關(guān)（r=0.896，P=0.001），對(duì)照組TNF-α與IL-34無(wú)相關(guān)性（r=0.186，P=0.659）。

3 討論

TNF-ɑ是在病原菌、內(nèi)毒素或相關(guān)物質(zhì)誘導(dǎo)下，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等分泌的一種促炎因子，在骨吸收中發(fā)揮重要作用[10]。有報(bào)道在小鼠的根尖病損中發(fā)現(xiàn)TNF-α的表達(dá)，用藥物抑制小鼠的根尖病損后，小鼠病損組織中TNF-α的表達(dá)也受到抑制[11-12]。KIMAK等[13]在人根尖病損組織中也多次檢測(cè)到TNF-α的表達(dá)。本研究在慢性根尖肉芽腫中發(fā)現(xiàn)TNF-α的表達(dá)高于對(duì)照組，與之前結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)在慢性根尖肉芽腫中IL-34的表達(dá)高于對(duì)照組。2013年有學(xué)者報(bào)道牙周炎患者牙周膜細(xì)胞中IL-34的表達(dá)較高[14]。CHEMEL等[15]證實(shí)RA患者的滑膜中IL-34的表達(dá)較健康人高，本文的慢性根尖肉芽腫中IL-34表達(dá)較高，與前兩者一致。這可能因?yàn)槁愿馊庋磕[與牙周炎及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有共同特征（均伴有炎性骨破壞）有關(guān)。破骨細(xì)胞在骨改建中負(fù)責(zé)骨吸收，核因子κB受體活化因子配體和其配體結(jié)合后能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖、分化及成熟，促進(jìn)促吸收。集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF-1）與其配體結(jié)合后能夠協(xié)同核因子κB受體活化因子配體誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化，增加其活性。IL-34和CSF-1擁有共同的配體。IL-34可以代替CSF-1協(xié)同核因子κB受體活化因子配體調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化成熟，促進(jìn)骨吸收。在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)患者血清中，IL-34與核因子κB受體活化因子配體的表達(dá)呈正相關(guān)，且兩者均與骨密度水平呈負(fù)相關(guān)?？梢钥闯鯥L-34主要通過(guò)核因子κB受體活化因子配體參與骨組織的破壞吸收。IL-34在慢性根尖肉芽腫中對(duì)根尖骨組織的破壞可能與核因子κB受體活化因子配體有關(guān)。

CHEMEL[15]和HWANG等[16]分別報(bào)道，在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織及滑膜成纖維細(xì)胞中存在IL-34的表達(dá)，且TNF-α可以促進(jìn)IL-34的表達(dá)。RANKL在慢性根尖周炎的骨破壞中扮演重要角色，TNF-α、IL-34可通過(guò)調(diào)節(jié)核因子κB受體活化因子配體調(diào)節(jié)骨吸收。TNF-α在慢性根尖肉芽腫中除可以直接通過(guò)核因子κB受體活化因子配體調(diào)節(jié)骨破壞外，還可能通過(guò)IL-34間接調(diào)節(jié)其活性，調(diào)節(jié)炎性骨破壞[17-18]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TNF-α拮抗劑在臨床上能有效減輕類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的骨組織破壞[19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TNF-α拮抗劑可以減輕伴糖尿病小鼠的牙周炎癥[20]。本研究進(jìn)一步揭示TNF-α在慢性根尖肉芽腫中的作用機(jī)制，為后期臨床應(yīng)用TNF-α拮抗劑治療慢性根尖肉芽腫提供一定的理論依據(jù)。