徐嬌 朱楚然 都明理 王麗紅 隋春 魏建和

摘要：利用帶有促溶標(biāo)簽SUMO和純化標(biāo)簽6×His的原核表達(dá)載體，構(gòu)建了調(diào)控北柴胡皂苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子基因BcAP2-13的原核表達(dá)載體p13-SUMO-His6。載體熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）后，用異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)培養(yǎng)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析表明，28 ℃和37 ℃不同溫度誘導(dǎo)條件下均得到了融合蛋白13-SUMO-His 6。以Ni-NTA柱純化的融合蛋白為抗原，免疫成年兔4次以制備多克隆抗體。間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果表明，所得抗體效價(jià)較高。提取北柴胡毛狀根及BcAP2-13超表達(dá)毛狀根的總蛋白，免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明，在2種毛狀根蛋白樣品中均能檢測(cè)到與預(yù)計(jì)13-SUMO-His6蛋白分子量大小一致的條帶，BcAP2-13過表達(dá)毛狀根總蛋白樣品的條帶強(qiáng)于普通毛狀根總蛋白樣品的條帶，與預(yù)期一致。成功制備了北柴胡BcAP2-13的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究北柴胡轉(zhuǎn)錄因子BcAP2-13的確切作用位點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：北柴胡;轉(zhuǎn)錄因子;原核表達(dá);多克隆抗體制備;免疫印跡

中圖分類號(hào)： S188;S567.7+90.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）10-0066-03

1994年Jofuku等首次發(fā)現(xiàn)了AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在模式植物擬南芥[Arabidopsis thaliana （L.）Heynh]中調(diào)控花發(fā)育[1]。AP2/ERF是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，含有由60～70個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域[2]。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子參與水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯、脫落酸（ABA）等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3-5]，已證實(shí)其中多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控重要藥用植物的藥效成分合成。如在轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)春花中過表達(dá) ORCA3-G10H提高了長(zhǎng)春質(zhì)堿、阿瑪堿的含量，降低了脫水長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春堿含量[6]。黃花蒿中的一個(gè)AP2轉(zhuǎn)錄因子TAR1在調(diào)控腺毛形態(tài)、表皮蠟質(zhì)組成和青蒿素含量中起至關(guān)重要的作用。抑制TAR1基因表達(dá)降低青蒿素含量，基因過表達(dá)則增加青蒿素含量[7]。筆者所在課題組前期克隆到了1個(gè)AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因BcAP2-13，間接試驗(yàn)證實(shí)了這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控柴胡皂苷生物合成，為直接證實(shí)其調(diào)控作用，找到其直接作用的基因靶點(diǎn)，Chip免疫共沉淀是重要方法之一，利用這一方法有必要先獲得BcAP2-13的特異抗體。蛋白特異抗體在蛋白功能的研究中發(fā)揮著重要的作用，為基因編碼蛋白功能的研究提供必要條件[8-9]。本研究利用大腸桿菌原核表達(dá)獲得了BcAP2-13的融合蛋白，Ni-NTA親和柱純化后作為免疫原，制備了BcAP2-13的多克隆抗體。間接酶聯(lián)免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定了抗體的效價(jià)，Western-blot印跡檢測(cè)了抗體的特異性，為進(jìn)一步深入開展BcAP2-13基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物、細(xì)菌和載體 北柴胡毛狀根為筆者所在課題組前期由發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)北柴胡無菌苗獲得，北柴胡BcAP2-13超表達(dá)毛狀根是由含有BcAP2-13基因的發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)獲得。大腸桿菌TOP10菌株、大腸桿菌BL21（DE3）菌株和原核表達(dá)載體pET-28a-sumo購(gòu)自武漢戴安生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 高保真DNA聚合酶（PrimeSTARHS DNAPolymerase）購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)于NEB公司;DNA純化回收試劑盒（Universal DNAPurification Kit）、質(zhì)粒小提試劑盒（TIANprep Mini PlasmidKit）購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、弗氏完全佐劑（Freunds adjuvantcomplete）和弗氏不完全佐劑（Freunds adjuvant incomplete）購(gòu)于Sigma公司;0.45 μm硝酸纖維素膜（Nitro Cellulose）購(gòu)于GE Healthcare Life Science;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，簡(jiǎn)稱IgG）購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;尿素購(gòu)于Amresco公司;ECL工作液（Detection reagent 1，Detection reagent 2）購(gòu)于BioRad公司。SDS-PAGE預(yù)制膠購(gòu)于武漢金斯瑞公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)BcAP2-13基因序列，設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增正向序列PL040F：5′-CGCGGATCCATGATGCAATCAAATTTTG-3′和反向序列L040R：5′-GACGTCGACTCAAACAATTAAAAAAG-3′（劃線部分為酶切位點(diǎn)）。以BcAP2-13-PDOR221重組載體質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94 ℃ 5 min;98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。回收PCR產(chǎn)物，BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切后與同樣雙酶切后的pET-28a-sumo載體相連，得到重組質(zhì)粒 p13-SUMO-His6，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α，通過測(cè)序驗(yàn)證重組載體中基因序列的正確性。

1.2.2 重組表達(dá)載體p13-SUMO-His6在大腸桿菌中的表達(dá) （1）小樣表達(dá)：提取質(zhì)粒p13-SUMO-His6，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），挑選轉(zhuǎn)化平板的6個(gè)單克隆，分別接種3 mL卡那抗性液體培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min搖培至D600 nm值為0.5～0.6，加入IPTG終濃度為0.5 mmol/L，20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)3.5 h。離心收集菌體，移除上清液，按10 mL PBS/g 菌體的量重懸菌體;利用超聲破碎儀進(jìn)行菌體細(xì)胞破碎，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。結(jié)果顯示蛋白質(zhì)在上清和包涵體中均有表達(dá)，且上清中的量滿足繼續(xù)進(jìn)行大量表達(dá)純化。