胡軼虹，白春艷，李宗樹，呂金珠，楊春麗，孫宏俠

隨著全球老齡化的進(jìn)程，阿爾茨海默病成為全球醫(yī)療界急于攻克的難題之一。臨床病理研究指出本病有個比較長的臨床前階段；事實上認(rèn)為腦組織病理，包括淀粉樣斑及神經(jīng)纖維纏結(jié)，早于典型神經(jīng)細(xì)胞死亡及后續(xù)認(rèn)知及行為癥狀出現(xiàn)的10～20 y[1]。因此，體液和影像的生物學(xué)標(biāo)志物能在癥狀初期或臨床前階段得到證實，在這一時期干預(yù)治療，可能更好的保留認(rèn)知功能[2]。本研究聚焦于輕度認(rèn)知損害階段，檢測患者的血漿microRNA-135a及microRNA-210，探討其作為MCI早期診斷標(biāo)志物的價值。

1 材料和方法

1.1 實驗分組 (1)正常對照組(AMC)，年齡≥60歲，保留正常的日常生活活動能力，無神經(jīng)系統(tǒng)疾病、精神疾病及其他可導(dǎo)致認(rèn)知功能損害的醫(yī)療情況;(2)輕度認(rèn)知損害組(MCI)，年齡≥60歲，用簡易智力狀態(tài)檢查量表(MMSE)及臨床癡呆評定量表(CDR)進(jìn)行認(rèn)知功能臨床評價。認(rèn)知損害診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1) 28≥MMSE≥21；(2)非癡呆；(3)記憶力減退主訴；(4)保存一般認(rèn)知功能；(5)較完整的日常生活活動能力(允許2個或更少的問題:電話、準(zhǔn)備三餐、理財、完成家務(wù));(6)根據(jù)教育程度的校正：12 y以下+1分；6 y以下+2分。根據(jù)頭部CT或MRI影像學(xué)檢查及Hachinski缺血量表評分分為：(1)VD-MCI組： Hachinski缺血量表評分≥7分伴有影像學(xué)腦血管病改變；(2)AD-MCI組：Hachinski缺血量表評分<4分且無影像學(xué)腦血管病改變。3組均行全面體格檢查和神經(jīng)系統(tǒng)檢查，實驗室檢查(即血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、維生素B12和葉酸水平、甲狀腺功能、同型半胱氨酸)和神經(jīng)影像學(xué)(即核磁共振或CT)檢查。本研究所有受試者均知情同意。

1.2 標(biāo)本采集 空腹12 h后，用EDTA真空采血管采血，立即在1380×g離心5 min。樣本保存在4 ℃等待血漿制備，其后用1.5 ml Eppendorf管分裝，儲存在-80 ℃，直到進(jìn)一步使用。

1.3 小RNA提取及microRNA-135a及microRNA-210測定 應(yīng)用miENeasy Mini Kit(Qiagen，德國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Qiagen，德國)，按照說明書進(jìn)行RT-qPCR,以cel-miR-39為外參，使用2-ΔCT法計算microRNA-135a及microRNA-210水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 不同組間定量數(shù)據(jù)的比較應(yīng)用配對t檢驗。對于分類變量應(yīng)用χ2檢驗。多個組間定量數(shù)據(jù)比較用ANOVA方差分析。miRNA水平與MMSE評分相關(guān)性用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料 篩選2016年-2018年于吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院患者，根據(jù)入組標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出80人，年齡為60～94歲，其中AMC為28人，男13人，女15人，年齡中位數(shù)69歲；VD-MCI 28人，男19人，女9人，年齡中位數(shù)72歲；AD-MCI組24人，男13人，女11人，年齡中位數(shù)73歲。采用χ2檢驗對3組患者的性別構(gòu)成進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3組患者的性別構(gòu)成并無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.199，P>0.05)，應(yīng)用t檢驗對年齡進(jìn)行比較，差異無顯著性(P>0.05)(見表1)。

2.2 血漿microRNA-135a檢測AMC組患者血漿microRNA-135a水平為(9.87×10-7±5.66×10-7)；VD-MCI組患者血漿microRNA-135a水平為(4.17×10-7±8.35×10-8)；AD-MCI組血漿microRNA-135a水平為(2.83×10-7±1.72×10-7)。采用ANOVA方差分析對3組患者的血漿microRNA-135a進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3組患者組間microRNA-135a水平存在顯著差異(F=30.76,P=0.00,P<0.05)(見圖1、表2)。

2.3 血漿microRNA-210檢測 AMC組患者血漿microRNA-210水平為(1.30×10-5±7.07×10-6)；VD-MCI組血漿microRNA-210水平為(4.27×10-5±1.09×10-5)；AD-MCI組血漿microRNA-210水平為(6.96×10-5±2.48×10-5)。采用ANOVA方差分析對3組患者的血漿microRNA-210進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3組間存在顯著差異(F=80.43,P=0.00,P<0.05)(見表2、圖2)。

2.4 MMSE評分與microRNA水平相關(guān)性分析 對VD-MCI組的MMSE評分與血漿microRNA兩個指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，統(tǒng)計結(jié)果顯示，MMSE評分與血漿microRNA-135a水平間(r=0.20,P=0.31,P>0.05)，與血漿microRNA-210水平間(r=-0.12，P=0.56,P>0.05)并無明顯統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。對AD-MCI組的MMSE評分與血漿microRNA兩個指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，MMSE評分與血漿microRNA-135a水平間(r=0.24，P=0.25,P>0.05)；血漿microRNA-210水平間(r=-0.28，P=0.18，P>0.05)并無顯著相關(guān)性。

表1 入組患者基本臨床資料

3組患者年齡及性別均無明顯差異P>0.05

表2 3組患者的血漿microRNA-135a及microRNA-210檢測比較

注：VD-MCI組及AD-MCI組血漿microRNA-135a明顯下降，且AD-MCI組下降更為明顯(P<0.05)；VD-MCI組及AD-MCI組血漿microRNA-210明顯升高，且AD-MCI組升高更為明顯(P<0.05)

注：A代表AMC組;B代表VD-MCI組;C代表AD-MCI組。VD-MCI組及AD-MCI組血漿microRNA-135a明顯下降，且AD-MCI組下降更為明顯(P<0.05)

圖1 血漿microRNA-135a檢測結(jié)果曲線圖

注：A代表AMC組;B代表VD-MCI組;C代表AD-MCI組。VD-MCI組及AD-MCI組血漿microRNA-210明顯升高，且AD-MCI組升高更為明顯(P<0.05)

圖2 血漿microRNA-210檢測結(jié)果曲線圖

3 討 論

目前，AD和其他形式的癡呆的診斷基于分析患者的認(rèn)知功能。神經(jīng)元之間的淀粉樣斑塊，神經(jīng)纖維tau蛋白纏結(jié)和腦組織的整體萎縮是AD的特點，有很多基于這些現(xiàn)象而嘗試開發(fā)診斷檢查。最近發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示高靈敏度的AD檢測，包括作為生物標(biāo)記物的腦脊液(CSF)中β淀粉樣蛋白1-42，總tau蛋白，磷酸化tau 181P蛋白的檢測[3,4]。然而，CSF的侵襲性收集過程限制了這些檢測方法的日常臨床使用。新的成像技術(shù)，包括體內(nèi)檢測β淀粉樣蛋白沉積的PET掃描[5～7]，越來越敏感特異，但不適合初次篩選。一些團(tuán)隊基于大量的分析人類血液中蛋白質(zhì)或抗體[8～10]，報道了關(guān)于AD診斷的血液化驗分析，這極大的鼓舞了科學(xué)工作者繼續(xù)在此方向進(jìn)行深入探討。

microRNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)， miRNA在大腦發(fā)育、神經(jīng)元分化、突觸聯(lián)系和樹突棘形成等過程中發(fā)揮重要作用[11]。而miRNA表達(dá)異常參與了阿爾茨海默病等認(rèn)知功能障礙性疾病的發(fā)病過程， 且這種表達(dá)異常不僅在病變腦區(qū)可以檢測到，在血漿、腦脊液等外周體液亦可發(fā)現(xiàn)[12]。這些發(fā)現(xiàn)使得將miRNA作為標(biāo)記物早期檢測和評估認(rèn)知功能障礙成為可能。更為重要的是，由于可以靶向調(diào)節(jié)多種基因，miRNA可能是我們進(jìn)一步理解認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制和研發(fā)新型藥物的關(guān)鍵分子[13]。

國內(nèi)學(xué)者劉辰庚等研究發(fā)現(xiàn)，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型海馬組織中microRNA-135a較野生型小鼠顯著下調(diào)，且AD小鼠模型CSF和血清中的microRNA-135a亦顯著下調(diào)[14]。由于microRNA-135a相對BACE1和Aβ42而言處于生物級聯(lián)作用的上游，故microRNA-135a可能對于AD的早期診斷有潛在幫助。這個猜想也在與Aβ42陽性率的橫向比較中得以印證-外周血microRNA-135a可能是較Aβ42更適宜的AD診斷，特別是早期診斷的標(biāo)志物[15]。本研究發(fā)現(xiàn)microRNA-135a在輕度認(rèn)知損害患者中降低，在AD源性MCI中降低更為明顯，與劉辰庚的實驗研究一致，證明microRNA-135a可作為AD源性MCI早期篩選診斷標(biāo)志物。

microRNA-210的上調(diào)與很多實體腫瘤相關(guān)，而且它的升高常提示預(yù)后不良。新近研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-210與細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)、細(xì)胞再生、分化、血管再生等有關(guān)[16～18]。然而，在活體內(nèi)，microRNA-210在缺血后的神經(jīng)形成中起促進(jìn)作用[19]還是抑制作用[20]仍處于爭論中。Lou[21]等研究認(rèn)為，microRNA-210參與了在腦缺血后的血管新生，在缺血后的腦組織中表達(dá)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，在輕度認(rèn)知損害的患者中，microRNA-210明顯升高，在AD源性MCI中升高更為明顯，這與我們的實驗設(shè)想有差距。因此，需要我們繼續(xù)擴(kuò)大研究的樣本量，并對入組的患者進(jìn)行隨訪研究?？傊窈筮€需要對特定miRNA的靶基因、上下游通路及其是否具有逆轉(zhuǎn)認(rèn)知下降的功能進(jìn)行更為深入的研究和機(jī)制探討。