張 靜，杜鳳霞，于珊珊，蔡華丹，劉麗萍

(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心藥學部，北京 100039)

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)(屬嗜肝DNA病毒科[1])感染引起的以肝臟炎性病變?yōu)橹鞯牟⒖梢鸲嗥鞴贀p害的一種傳染病。該病可廣泛流行于世界各國，一年四季均可發(fā)病，但多屬散發(fā)；臨床起病緩慢，以亞臨床型及慢性型較常見，并使患者死于肝硬化和肝癌的風險增加[2]。近年來，乙型病毒性肝炎發(fā)病率呈明顯升高趨勢，全球HBV感染者多達3.6億，我國約有1.2億感染者，乙型病毒性肝炎已成為我國嚴重的公共衛(wèi)生問題[3]。六味五靈片是2006年獲得批準上市的國家三類中藥，其處方來源于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心(原解放軍第302醫(yī)院)，其組方由南五味子、連翹、女貞子、莪術、苣荬菜和靈芝孢子粉6味中藥構(gòu)成，可滋腎養(yǎng)肝、活血解毒，用于治療慢性乙型肝炎氨基轉(zhuǎn)移酶升高，中醫(yī)辨證屬于肝腎不足、邪毒瘀熱互結(jié)，癥見脅肋疼痛，腰膝酸軟，口干咽燥，倦怠、乏力，納差，脘腹脹滿，身目發(fā)黃或不黃，小便色黃，頭昏目眩，兩目干澀，手足心熱，失眠多夢，舌暗紅或有瘀斑、苔少或無苔，脈弦細。該藥臨床療效好、使用量大，2007年榮獲第三屆“中國肝類用藥市場十大影響力品牌”稱號。

中藥及其復方具有多成分、多靶點和多途徑的臨床作用特點，這種復雜性使得中藥藥效物質(zhì)基礎不明確、作用機制不清楚、中藥材質(zhì)量難控制和臨床缺乏科學合理的藥效及安全性評價體系，從整體到組織器官、細胞和分子水平都很難進行全面、系統(tǒng)的研究，從而使得中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展緩慢。因此，闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎、作用靶點是推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重要環(huán)節(jié)[4]。網(wǎng)絡藥理學基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡的基礎，通過分析基因網(wǎng)絡庫、蛋白網(wǎng)絡庫、疾病網(wǎng)絡庫和藥物網(wǎng)絡庫等現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的信息資料[5]，采用計算機虛擬計算構(gòu)建生物信息網(wǎng)絡并分析網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)[6]，從整體上預測中藥復方的作用靶點。本研究基于網(wǎng)絡藥理學，初步探究六味五靈片抗乙型病毒性肝炎的潛在作用靶點。

1 資料與方法

1.1 資料來源

數(shù)據(jù)庫和軟件主要包括：中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[7]、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)(https://www.omim.org/)、UniProt(https://www.uniprot.org/)、DAVID數(shù)據(jù)庫(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)(https://david.ncifcrf.gov/)、交互蛋白數(shù)據(jù)庫(database of interacting protein，DIP)(http：//dip.doembi.ucla.edu)和Cytoscape 3.7.1軟件。

1.2 方法

1.2.1 六味五靈片的主要化學成分及其作用靶點挖掘：采用TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索六味五靈片中的主要化學成分，根據(jù)各化合物的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、類藥性(drug-likeness，DL)篩選出符合條件的化合物，以“OB≥30%，DL≥0.18”作為篩選條件?；赥CMSP數(shù)據(jù)庫，將六味五靈片中的有效化合物逐一配對潛在作用靶點蛋白，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫得到各靶點蛋白對應的基因名稱和Uniprot數(shù)據(jù)庫識別碼。

1.2.2 乙型病毒性肝炎靶點篩選：通過OMIM數(shù)據(jù)庫，篩選乙型病毒性肝炎相關基因和蛋白靶點，建立乙型病毒性肝炎靶點數(shù)據(jù)集，其中靶點連接蛋白通過DIP數(shù)據(jù)庫獲得。為便于分析，將上述所有靶點轉(zhuǎn)化為Uniprot數(shù)據(jù)庫識別碼格式。

1.2.3 “化合物-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡的構(gòu)建和分析：將篩選到的化合物成分、成分作用靶點、疾病作用靶點和交互蛋白之間的交互關系通過“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”交互網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫進行分析。分析結(jié)果導入Cytoscape 3.7.1軟件中進行可視化，同時分析直接靶點的拓撲參數(shù)。

1.2.4 基因本體(gene ontology，GO)生物過程和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析：將Cytoscape 3.7.1軟件分析得到的直接作用靶點的Uniprot數(shù)據(jù)庫識別碼導入功能注釋工具DAVID中，以P<0.01為閾值，篩選排序居前20位的GO生物過程和KEGG代謝通路[8]。

2 結(jié)果

2.1 化合物收集及其相關作用靶點篩選

六味五靈片中化合物成分共389個，符合篩選條件的主要化合物48個(見表1)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中逐一對應相關作用靶點，重復靶點僅保留1個，共得到主要化合物相關作用靶點蛋白242個，然后將每種蛋白名稱輸入Uniprot數(shù)據(jù)庫中，來源選“Human”，得到對應的靶點基因名稱。

2.2 乙型病毒性肝炎靶點獲取結(jié)果

基于OMIM數(shù)據(jù)庫，共篩選得到301個疾病相關靶點。

2.3 網(wǎng)絡構(gòu)建和分析

為客觀揭示六味五靈片抗乙型病毒性肝炎的可能活性化合物及潛在作用靶點，基于網(wǎng)絡藥理學分析，構(gòu)建了“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡并進行可視化分析，使六味五靈片抗乙型病毒性肝炎直觀呈現(xiàn)出來，并對各靶點的相關參數(shù)進一步分析，見圖1—2，圖中，三角形為候選活性化合物，正方形為藥物和疾病共同直接作用靶點，圓形為藥物與疾病作用靶點。六味五靈片抗乙型病毒性肝炎的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡中，共篩選得到8個抗乙型病毒性肝炎主要活性成分和7個直接作用靶點，見表2—3。

圖1 六味五靈片抗乙型病毒性肝炎的“化合物-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡Fig 1 Interactive network of “compound-target-disease” of Liuwei Wuling tablets against viral hepatitis B

圖2 六味五靈片抗乙型病毒性肝炎直接作用靶點一級“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡Fig 2 Direct targets of the first class interactive network of “compound-target-disease” of Liuwei Wulin tablets against viral hepatitis B

表1 候選化合物基本信息Tab 1 Basic information of candidate compounds

2.4 直接作用靶點GO生物過程和KEGG通路富集分析

GO生物過程分析共富集得到10個條目，見圖3；KEGG通路注釋分析共得到可能相關的通路10條，分別為“Cytokine-cytokine receptor interaction”(細胞因子-細胞因子-受體相互作用)、“Asthma”(哮喘)、“Allograft rejection”(移植排斥反應)、“Pathways in cancer”(惡性腫瘤的途徑)、“Amyotrophic lateral sclerosis(ALS)”(肌萎縮側(cè)索硬化)、“Melanoma”(黑色素瘤)、“Colorectal cancer”(結(jié)直腸癌)、“Apoptosis”(細胞凋亡)、“Prostate cancer”(前列腺癌)和“Systemic lupus erythematosus”(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)，見圖4。

表2 六味五靈片中預測主要活性成分Tab 2 Predicted active ingredients of Liuwei Wuling tablets in Liuwei Wulin tablets

表3 六味五靈片抗乙型病毒性肝炎“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡中直接作用靶點拓撲參數(shù)分析Tab 3 Topological parameter analysis of direct targets of the first class interactive network of “compound-target-disease” of Liuwei Wulin tablets against viral hepatitis B

圖3 六味五靈片抗乙型病毒性肝炎直接作用靶點的GO生物過程Fig 3 GO biological process of direct targets of Liuwei Wulin tablets against viral hepatitis B

圖4 六味五靈片抗乙型病毒性肝炎直接作用靶點的KEGG代謝通路Fig 4 KEGG Pathway analysis of direct targets of Liuwei Wulin tablets against viral hepatitis B

3 討論

六味五靈片為中藥復方制劑，具有保肝、抗炎、解毒及改善肝組織病理等優(yōu)點，可以有效減輕肝損傷，延緩慢性肝病的發(fā)展進程，臨床上常與抗病毒藥聯(lián)合應用以達到治療效果[9]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，系統(tǒng)地對六味五靈片抗乙型病毒性肝炎的潛在靶點進行挖掘，最終得到7個直接作用靶點蛋白(肝細胞生長因子受體、雄激素受體、周期蛋白A2、白細胞介素10、腫瘤壞死因子、細胞腫瘤抗原p53和含桿狀病毒IAP重復序列的蛋白質(zhì)5)、10條GO生物過程及10條KEGG代謝通路。

肝細胞生長因子受體是酪氨酸激酶膜受體，其不僅對肝臟再生、腫瘤發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著重要作用，而且在其他組織如腎臟、肺、乳腺、肌肉和神經(jīng)組織的發(fā)育、再生及體內(nèi)平衡中不可或缺[10]。目前，性別因素與乙型病毒性肝炎相關性的研究主要集中于性甾體激素及其受體，性甾體激素分泌及其受體表達水平對慢性乙型肝炎發(fā)病和進展的影響可能表現(xiàn)在2個方面，即：病毒復制及其抗原表達水平；宿主的免疫應答效度性別和年齡差異[11]。周期蛋白A主要參與細胞分裂S期和G2-M期的調(diào)節(jié)，其過表達將使細胞過度增殖，從而影響細胞周期的進程；而且，周期蛋白A的差異表達可能是HBV感染后肝細胞癌變的重要原因[12]。白細胞介素10具有促炎和耐受的雙重作用，可以預測乙型病毒性肝炎慢性化及病毒持續(xù)感染，參與免疫細胞、炎癥細胞及腫瘤細胞等多種細胞的生物調(diào)節(jié)[13]。腫瘤壞死因子是一種重要的炎性因子，其過度分泌可以促進HBV在肝細胞內(nèi)的復制，但其水平的升高也是病毒復制活躍的患者體內(nèi)的保護性反應[14]。

中藥成分復雜，具有多靶點、多環(huán)節(jié)和多效應的作用特點，在臨床應用中可達到整體治療效果。但由于其藥物種類繁多、活性成分不明確以及作用機制模糊，在臨床上很難做到靶向治療，因此，對于一些急癥、重癥無法達到理想的治療效果。本研究依托網(wǎng)絡生物信息及計算機虛擬分析，對中藥復方潛在作用靶點進行初步挖掘，可為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究提供一定參考；但由于分析過程中并未考慮中醫(yī)“君臣佐使”配伍關系及用法、用量等因素[15]，故其結(jié)果尚需進一步動物實驗和臨床試驗驗證。