韓 茜1，許紅彬2，馮 云1，田俊華3，章少在2，吳 敏4，張 婧1，潘 虹1，李元元，梁國棟

立克次體病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的人獸共患自然疫源性疾病，其病原體立克次體目(Rickettsiales)微生物是一類嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和代謝方式等方面與細(xì)菌類似，通過蜱、螨、蚤等節(jié)肢動物叮咬人和動物而傳播[1]?！恫苁舷到y(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》將立克次體目分為 3 科，即立克次體科(Rickettsiaceae)、無形體科(Anaplasmataceae)和全孢菌科(Holosporaceae)[1-2]。立克次體科主要包括立克次體屬(Rickettsia)、斑疹傷寒或莫氏立克次體(R.typhi)和東方體屬(Orientia)；無形體科包括無形體屬(Anaplasma)、埃立克體屬(Ehrlichia)、埃及小體屬(Eegyptianalla)、考德里體屬(Cowdria)、新立克次體屬(Neorickettsia)、沃爾巴克體屬(Wolbachia)和客鮑體屬(Xenohalioti)；全孢菌科包括全孢螺菌屬(Holospora)[1-2]。

根據(jù)現(xiàn)有研究，病原體分離以及分子生物學(xué)、血清學(xué)證據(jù)表明中國至少存在10種立克次體病[3]，經(jīng)蜱傳播的斑點熱群立克次體(Spotted fever group rickettsia，SFGR)主要包括西伯利亞立克次體(R.sibirica)、黑龍江立克次體(R.heilongjiangensis)、內(nèi)蒙古立克次體(R.mongolotimonae)、虎林立克次體(R.hulinii)和日本立克次體等[4-5]。無形體病和埃立克體病是近年來發(fā)現(xiàn)的一類重要蜱傳立克次體病，如引起人類疾病的人單核細(xì)胞埃立克體病(Human monocytic ehrlichiosis，HME)和人粒細(xì)胞無形體病(Human granulocytic anaplasma，HGA)[6-8]。以上研究對我國蜱攜帶和傳播的立克次體和埃立克體導(dǎo)致疾病的預(yù)防控制提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

江西省地處中國大陸中東部，地理景觀復(fù)雜，氣候溫暖，適宜多種吸血昆蟲的滋生和繁殖。此前研究顯示江西省存在多種蜱[9]，但是缺少蜱及其攜帶病原體關(guān)系的研究。2016年4月我們在江西省贛州市的龍南、安遠(yuǎn)、于都、崇義4個縣采集蜱，進(jìn)行蜱種類鑒定和蜱攜帶立克次體和埃立克體等病原體的調(diào)查研究，實驗結(jié)果如下所述。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本采集 2016年4月12日至18日，在江西省贛州市龍南、安遠(yuǎn)、于都、崇義4縣進(jìn)行蜱的采集。放牧動物牛、羊等體表有蜱吸附，用鑷子輕輕夾取，小心拔下，防止蜱頭節(jié)斷裂在動物皮膚內(nèi)。手持白布旗在野外草地中拖拽布旗，行走50 m左右時，翻轉(zhuǎn)布旗，查找布旗表面的爬行蜱，用鑷子夾取，根據(jù)《醫(yī)學(xué)蜱螨學(xué)》[10]在采集現(xiàn)場進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定分類后放入液氮凍存運回實驗室待檢測。

1.2立克次體和埃立克體基因提取和檢測 蜱分批放入預(yù)冷的組織研磨器加入2 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Minimal essential medium，MEM)清洗，棄去液體，再加入1mL含10%雙抗MEM，研磨至組織碎片基本消失，取200 μL蜱的研磨混懸液，利用天根生化科技(北京)有限公司(中國)TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(Cat.#DP304-03；Lot#Q5629)提取DNA。用表1中的引物RpCS877p/ RpCS1258n[11]和Eh-out1/ Eh-out2[12]擴(kuò)增立克次體gltA基因和埃立克體16SrRNA基因。PCR反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 9.5 μL，2×Dream Tag Green PCR Master Mix (Thermo)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL。擴(kuò)增條件：RpCS877p/ RpCS1258n為94 ℃ 5 min，95 ℃變性20 s，48 ℃退火30 s，60 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)，4 ℃保存。Eh-out1/ Eh-out2為95 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，共40個循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。DNAMarkerDL2000購自大連寶生物公司。

表1 本研究所用引物信息
Tab.1 Primer sequences for virus identification in this study

種類引物名稱擴(kuò)增片段/長度序 列參考文獻(xiàn)立克次體RpCS877pgltA/381 bp5′-GGGGGCCTGCTCACGGCGG-3′[11]RpCS1258n5′-ATTGCAAAAAGTACAGTGAAC-3′埃立克體Eh-out116S rRNA/653 bp5′-TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG-3′[12]Eh-out25′-CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC-3′

1.3序列測定及分子遺傳進(jìn)化分析 陽性PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司昆明辦事處完成測序。從GeneBank下載相關(guān)序列，包括不同國家、不同年代的立克次體屬和埃立克體屬的代表株。使用DNASTAR 軟件包中的Seqman軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接和質(zhì)量分析；使用BioEdit(version 7.0.5.3)和ClustalX 1.8軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的比對；使用Gene DOC軟件進(jìn)行核苷酸和氨基差異度分析；使用MEGA 5.05軟件完成基于Neighbour-joining(NJ)方法的進(jìn)化樹繪制，Bootstrap值設(shè)定為1000[13]。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本采集和鑒定 本次調(diào)查在江西省贛州市的牛、羊等動物體表和草地上共采集蜱395只，其中龍南縣201只、安遠(yuǎn)縣16只、于都縣160只和崇義縣18只。按采集地點、時間和種類相同的蜱每5～13只為一批共分為43批標(biāo)本。鑒定結(jié)果顯示，贛州市龍南縣2屬3種蜱為血蜱屬的長角血蜱、具角血蜱和扇頭蜱屬的微小扇頭蜱；于都縣2屬2種蜱為微小扇頭蜱和長角血蜱；安遠(yuǎn)縣為微小扇頭蜱；崇義縣為嗜群血蜱(表2)。

表2 江西省贛州市4縣蜱標(biāo)本采集信息和PCR檢測結(jié)果
Tab.2 Specimen collection and PCR detection of ticks in 4 counties of Ganzhou City, Jiangxi Province

序號采集地標(biāo)本號種類數(shù)量宿主立克次體(gltA)埃立克體(16S rRNA)1龍南縣LN1601長角血蜱12牛--2LN1602長角血蜱6牛--3LN1603長角血蜱8牛--4LN1604長角血蜱9牛--5LN1605長角血蜱7牛--6LN1606具角血蜱7牛日本立克次體-7LN1607具角血蜱5牛日本立克次體-8LN1608具角血蜱7牛日本立克次體-9LN1609具角血蜱10牛日本立克次體-10LN1610具角血蜱10牛日本立克次體-11LN1611具角血蜱10牛日本立克次體-12LN1612具角血蜱10牛日本立克次體-13LN1613具角血蜱10牛日本立克次體-14LN1614具角血蜱10牛日本立克次體-15LN1615具角血蜱10牛扇頭蜱立克次體-16LN1616具角血蜱10牛日本立克次體-表2(續(xù))序號采集地標(biāo)本號種類數(shù)量宿主立克次體(gltA)埃立克體(16S rRNA)17LN1617具角血蜱10牛日本立克次體-18LN1618具角血蜱10牛日本立克次體-19LN1619微小扇頭蜱10牛--20LN1620微小扇頭蜱10牛馬賽立克次體-21LN1621微小扇頭蜱10牛日本立克次體-22LN1622微小扇頭蜱10牛日本立克次體-23安遠(yuǎn)縣AY1601微小扇頭蜱5牛--24AY1602微小扇頭蜱5牛--25AY1603微小扇頭蜱6牛--26于都縣YD1601微小扇頭蜱10牛--27YD1602長角血蜱10牛--28YD1603長角血蜱10牛--29YD1604長角血蜱10牛--30YD1605長角血蜱10牛--31YD1606長角血蜱10草地-埃立克體32YD1607長角血蜱10草地--33YD1608長角血蜱10草地--34YD1609長角血蜱10奶牛--35YD1610長角血蜱10奶牛--36YD1611長角血蜱10奶牛--37YD1612長角血蜱10山羊--38YD1613長角血蜱10山羊--39YD1614長角血蜱10山羊--40YD1615長角血蜱10山羊--41YD1616長角血蜱10山羊--

注：表中“—”代表PCR實驗結(jié)果為陰性。

2.2立克次體基因檢測和分析 用立克次體屬引物RpCS877p/RpCS1258n擴(kuò)增gltA基因，結(jié)果顯示，43批標(biāo)本中獲得17批陽性PCR產(chǎn)物，測序后將17株序列在GenBank中進(jìn)行Blast，結(jié)果提示均屬于立克次體科(表2)。選取不同種類的立克次體15株與本次實驗獲得的17株立克次體序列構(gòu)建基于gltA基因(334 bp)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，牛無形體(Anaplasmabovis)1株為外群。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示龍南縣22批蜱中檢測到16批陽性，來源于具角血蜱的LN1615株與扇頭蜱立克次體處于同一分支，來源于微小扇頭蜱的LN1620株與馬賽立克次體處于同一分支，其余12株來源于具角血蜱和2株來源于微小扇頭蜱與日本立克次體處于同一分支。崇義縣CY1602株來源于嗜群血蜱與R.raoultii處于同一分支。安遠(yuǎn)縣微小扇頭蜱檢測均為陰性(圖1)。

注：帶“▲”為本次實驗測序所得序列。圖1 立克次體gltA基因部分序列(334 bp)的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 334 bp segments of Rickettsia gltA gene

2.3埃立克體基因檢測與分析 用埃立克體屬引物Eh-out1/Eh-out2進(jìn)行PCR實驗，結(jié)果獲得1批陽性PCR產(chǎn)物(表2)。選取埃立克體屬中的18株，包括了犬埃立克體(E.canis)4株、查菲埃立克體(E.chaffeensis)3株、伊氏埃立克體(E.ewingii)3株、鼠埃立克體(E.muris)2株和反芻動物埃立克體(E.ruminantium)3株，牛無形體1株作為外群，與本次實驗獲得的YD1606株構(gòu)建基于16S rRNA基因(558 bp)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果提示于都縣YD1606株為來源于長角血蜱的埃立克體，與2010年日本長角血蜱中的Yonaguni206(HQ697589)、Yonaguni138(HQ697588)[14]和2009年韓國長角血蜱中的HLAE178(GU075695)[15]處于同一分支。

注：帶“▲”為本次實驗測序所得序列。圖2 埃立克體16S rRNA基因部分序列(558 bp)的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 558 bp segments of Ehrlichia 16S rRNA gene

3 討 論

蜱隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、蛛形綱(Arachnida)、寄螨目(Parasitiformes)、蜱總科(Ixodoidea)，又分為3個科：硬蜱科(Ixodidae)、軟蜱科(Argasidae)和納蜱科(Nuttalliellidae)[10]。中國有硬蜱科約100種，軟蜱科10種。我國東北部的大小興安嶺地區(qū)以全溝硬蜱(Ixodespersuleatus)為主，而我國南方地區(qū)嗜群血蜱多見[16-19]。根據(jù)鄧國藩等[20]，陸寶麟等[21]，楊曉軍等[22]，許紅彬等[9]的文獻(xiàn)報道，依據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征鑒定分類，江西省目前共有2科5屬14種蜱。本研究中贛州市龍南縣鑒定出蜱2屬3種，為血蜱屬的長角血蜱、具角血蜱和扇頭蜱屬的微小扇頭蜱，種類最多；其次為于都縣，鑒定出蜱2屬2種為微小扇頭蜱和長角血蜱；安遠(yuǎn)縣為微小扇頭蜱；崇義縣采集的蜱為嗜群血蜱，嗜群血蜱此前在江西省未見報道，為當(dāng)?shù)仳绶N的新紀(jì)錄。

本次研究首次通過分子生物學(xué)方法對江西省贛州市西南地區(qū)4縣捕獲的蜱攜帶的立克次體和埃立克體病原體進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，共獲得4種立克次體和1種埃立克體。根據(jù)核苷酸序列的分子遺傳分析顯示，江西省贛州市蜱中攜帶的立克次體主要有日本立克次體、馬賽立克次體、扇頭蜱立克次體和R.raoultii，其中日本立克次體檢出最多共14株，來源于龍南縣采集的具角血蜱(12株)和微小扇頭蜱(2株/LN1621和LN1622)，從分子生物學(xué)角度明確了具角血蜱、微小扇頭蜱與日本立克次體的關(guān)系；還從龍南縣的微小扇頭蜱中檢測到1株馬賽立克次體(LN1620)和具角血蜱中檢測到1株扇頭蜱立克次體(LN1615)。崇義縣的嗜群血蜱中檢測到1株R.raoultii(CY1602)。

斑點熱群立克次體是全球性分布的一類重要蜱傳病原體，目前報道該病的國家和地區(qū)高達(dá)50余個，包括落基山斑點熱、蜱傳北亞熱和日本斑點熱等。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實具有致病性的13個斑點熱群立克次體中，我國存在的斑點熱群立克次體有4種：西伯利亞立克次體、內(nèi)蒙古立克次體、黑龍江立克次體和虎林立克次體[23-24]。

1985年到1986年內(nèi)田孝宏在日本的四國地區(qū)病人血清中分離到一株日本立克次體，為斑點熱群立克次體的一個新種，命名為日本立克次體[25-27]，能引起紅疹熱。此后2003年菲律賓[28]、2006年韓國[29]、2007年泰國[30]等國家分別在對本國國內(nèi)發(fā)熱病人血清進(jìn)行立克次體感染狀況的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)存在日本立克次體感染，其中韓國得到了日本立克次體的分離株。我國1990-1999年，F(xiàn)eng Hui-min等[31]，林英姿等[32]在海南島地區(qū)采集病人血清進(jìn)行日本立克次體抗體檢測及病原分離，結(jié)果顯示1 030份血清[其中642份收集自海南島東南部、中南部(五指山周邊區(qū))和北部(?？谑?地區(qū)的人群血清]中檢測有2份標(biāo)本含有高滴度日本立克次體 IgG抗體 (≥ 1∶160)，日本立克次體 IgG抗體陽性率為2. 2%，遺憾的是并未分離到病原體。2017年Lu Miao等首次在武漢采集的褐黃血蜱(H.flava)、豪豬血蜱(H.hystricis)和中華硬蜱(I.sinensis)中檢測出日本立克次體[33]。本次實驗中江西蜱中有14株序列的分子遺傳進(jìn)化分析顯示與日本立克次體KX987344、KX987349和DQ909073處于同一進(jìn)化分支，提示這14株序列均為日本立克次體。這是首次在我國江西省采集的蜱中檢測到日本立克次體基因陽性。本次研究中日本立克次體的陽性率為32.56%(14/43)均來自于龍南縣。

本研究還從龍南縣的微小扇頭蜱中檢測到1株馬賽立克次體(LN1620)和具角血蜱中檢測到1株扇頭蜱立克次體(LN1615)；崇義縣的嗜群血蜱中檢測到1株R.raoultii(CY1602)。這3種立克次體均屬于斑點熱群立克次體[23]。近期的研究表明，R.raoultii是蜱致淋巴結(jié)病(Tick-borne lymphadenopathy，TIBOLA)的潛在病原體，其分布廣泛，目前已從13個國家和地區(qū)的革蜱等10種蜱中檢出[34]。本次研究從3種蜱中檢測到4種立克次體，提示江西省蜱中立克次體具有多樣性，該結(jié)果為研究當(dāng)?shù)卮嬖诘牧⒖舜误w引起人類感染導(dǎo)致的相關(guān)疾病具有重要意義。

埃立克體是一類嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的格蘭陰性球菌，屬于立克次體目、無形體科、埃立克體屬[1-2]，蜱是埃立克體的主要傳播媒介，可引起人或動物單核細(xì)胞埃立克體病、粒細(xì)胞埃立克體病、牛羊蜱傳熱、腺熱埃立克體病等。本研究從于都縣的長角血蜱中檢測到1株埃立克體(YD1606)，與2010年日本長角血蜱中的Yonaguni206(HQ697589)、Yonaguni138(HQ697588)[14]和2009年韓國長角血蜱中的HLAE178(GU075695)[15]處于同一分支。與埃立克體屬的犬埃立克體、查菲埃立克體、伊氏埃立克體、鼠埃立克體和反芻動物埃立克體均不在同一進(jìn)化分支，可能是一種新的埃立克體，與Matsumoto K等在日本的研究結(jié)果一致[14]，但是其分子生物學(xué)特性還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本次研究首次利用分子生物學(xué)方法對江西省贛州市4個縣采集的蜱攜帶的病原體進(jìn)行了分子遺傳學(xué)分析，檢測到4種立克次體和1種埃立克體，為今后開展蜱及其傳播病原體的調(diào)研，了解病原體在當(dāng)?shù)丶膊≈械淖饔锰峁┝烁鶕?jù)。