李海波，XING Baoshan

人工納米材料(engineering nanomaterials, ENMs)在空氣與水體凈化，生物醫(yī)藥、防護(hù)化妝品以及電子設(shè)備生產(chǎn)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但是，納米材料及其產(chǎn)品在生產(chǎn)、使用和處理過程中，通過各種途徑進(jìn)入環(huán)境，可能帶來難以預(yù)料的負(fù)面環(huán)境影響和生態(tài)效應(yīng)[1]，嚴(yán)重威脅生態(tài)系統(tǒng)健康與安全。納米顆粒作為污染物會隨大氣沉降、降水和灌溉等進(jìn)入農(nóng)田，在土壤環(huán)境中遷移和轉(zhuǎn)化，被植物吸收、富集和累積[2-3]，對環(huán)境和人體健康帶來不同程度的負(fù)面影響。

植物作為初級生產(chǎn)者，處于食物鏈的最低端，是生物蓄積的起點(diǎn)。納米顆粒通過食物鏈逐級高位富集，產(chǎn)生生物放大作用，對生物產(chǎn)生毒性效應(yīng)。研究表明，碳納米材料用來研究水環(huán)境的有機(jī)污染物吸附/清除機(jī)理，如多環(huán)芳烴(PAH)[4-6]，抗生素[7-11]，除草劑[12]等，其中農(nóng)田大量而廣泛使用的除草劑(如阿特拉津)殘留時間長，而且污染極具隱蔽性。

關(guān)于納米顆粒生物有效性及毒性的影響的研究還很有限，而關(guān)于納米顆粒與除草劑復(fù)合污染機(jī)理及其生物毒性的研究更是鮮見報道，因此，研究納米顆粒對農(nóng)田土壤-作物系統(tǒng)的生物毒性可為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

表1 CNTs的相關(guān)性質(zhì)

注：OD：粒徑；SSA：特定表面面積

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥劑 (1)95%乙醇，SiO2粉，CaCO3粉；(2)5%三氯乙酸(TCA)，0.67%硫代巴比妥酸(TBA)；(3)脯氨酸，3%磺基水楊酸，冰醋酸，甲苯，酸性茚三酮；(4)天然有機(jī)質(zhì)胡敏酸(HA)的提取采用0.1mol/L NaOH溶液，含C 47.4%，含N 1.19%。

1.1.2 供試作物 水稻品種：吉科稻512(SWCNTs)；大豆品種：黑農(nóng)35(納米TiO2和納米ZnO)；吉科黃豆20(SWCNTs)。

1.1.3 納米顆粒 選用的碳納米管為多壁碳納米管(MW)，羥基化多壁碳納米管(MH)，羧基化多壁碳納米管(MC)，以及單壁碳納米管(SW)，其相關(guān)性質(zhì)見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (1)MWCNTs實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為8個處理(見表2)，3次重復(fù)。(2)SWCNTs實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為8個處理(見表3)，3次重復(fù)。(3)選用的金屬氧化物納米顆粒為納米TiO2和納米ZnO，其相關(guān)性質(zhì)見表4。納米TiO2和納米ZnO實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為6個處理(見表5)，3次重復(fù)。

表2 MWCNTs實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 SWCNTs實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表4 納米TiO2 和納米ZnO的相關(guān)性質(zhì)

注：OD：粒徑

表5 納米TiO2 和納米ZnO實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖1多壁碳納米管暴露對水稻幼苗丙二醛含量的影響MW:多壁碳納米管;MH:羥基化多壁碳納米管;MC:羧基化多壁碳納米管,下同

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)葉綠素含量測定：采用95%乙醇提取葉綠體色素，采用分光光度計(jì)法在665 nm、649 nm、470 nm下測定吸光度，分別計(jì)算鮮樣的葉綠素a，b和類胡蘿卜素的含量。(2)脯氨酸含量測定：稱取水稻幼苗0.5 g，采用3%磺基水楊酸提取，高溫下與酸性茚三酮反應(yīng)，溶解在甲苯中，采用分光光度計(jì)法在520 nm下比色，計(jì)算鮮重樣品的脯氨酸含量。(3)丙二醛(MDA)的測定：稱取水稻幼苗0.5 g，提取(5%TCA)，研磨，水浴煮沸(加0.67%TBA)， 取上清液采用分光光度計(jì)法在450 nm、532 nm、600 nm下測定吸光度，計(jì)算MDA含量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 16.0進(jìn)行方差分析(ANOVA)和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米顆粒暴露對作物幼苗丙二醛含量的影響

丙二醛(MDA)是植物細(xì)胞膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，MDA含量增加會加劇細(xì)胞膜的損傷，因此，植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量常作為重要指標(biāo)。圖1顯示，隨著碳納米管濃度的增高，丙二醛含量表現(xiàn)為下降趨勢，低濃度碳納米管暴露下表現(xiàn)的尤為明顯，可能與碳納米管在水中的團(tuán)聚化增加有關(guān)，因?yàn)樘技{米管具有很強(qiáng)的疏水性。不同濃度MWCNTs暴露后，MDA含量比CK分別增加83%、3%和68%；而不同濃度MHCNTs暴露后，MDA含量比CK分別增加127%、119%和57%；不同濃度MCCNTs暴露后，MDA含量比CK分別增加32%、42%和5%。但碳納米管經(jīng)過HA改性后暴露，MDA含量顯著低于未經(jīng)HA改性的處理。ANOVA結(jié)果表明，碳納米管暴露下，不同處理的MDA含量具有顯著差異。

單壁碳納米管(SWCNTs)暴露下，水稻幼苗MDA含量隨著SWCNTs濃度增加而增高，在100 mg/L濃度(R5)下達(dá)到最高(見圖2)，比空白(R1)增加了15.8%。水稻幼苗在高濃度胡敏酸改性SWCNTs(R8，即50 mg /LSW+100 mg/L HA)暴露下，MDA含量比空白降低了10.1%，比添加原樣SWCNTs的3個處理(R3、R4、R5)分別降低了15.9%、20.0%和23.0%；胡敏酸改性SWCNTs暴露下，水稻幼苗MDA含量隨著胡敏酸濃度的增加而降低。

大豆幼苗在50 mg/L濃度SWCNTs(S4)暴露下MDA含量最高(見圖2)，比空白增加了49.5%。大豆幼苗在高濃度胡敏酸改性SWCNTs(S8)暴露下，MDA含量比空白降低了8.9%，比添加原樣SWCNTs的3個處理(S3、S4、S5)分別降低了28.2%、39.1%和31.4%；胡敏酸改性SWCNTs暴露下，大豆幼苗MDA含量隨著胡敏酸濃度的增加而顯著降低。

圖2 單壁碳納米管暴露對水稻及大豆幼苗丙二醛含量的影響

圖3 TiO2和ZnO納米顆粒的暴露對大豆幼苗丙二醛含量的影響

圖4 多壁碳納米管暴露對水稻幼苗脯氨酸含量的影響

圖3顯示，納米TiO2與納米ZnO暴露后提高了大豆幼苗丙二醛(MDA)含量。納米TiO2暴露下，T1和T2處理MDA含量比CK分別增加了97%和124%，HA改性的納米顆粒則分別增加54%和36%。納米ZnO暴露下T1和T2處理MDA含量比CK分別增加了251%和98%，HA改性的納米顆粒則分別增加113%和40%。ANOVA表明，納米TiO2與納米ZnO暴露不同處理間存在顯著差異(分別為P=0.006和P=0.008)，在濃度500 mg/L下，納米ZnO比納米TiO2的影響較為顯著。納米顆粒吸附HA后，MDA含量顯著下降，高濃度下表現(xiàn)更為明顯，表明HA具有顯著的解除納米顆粒生物毒性的作用。

2.2 納米顆粒暴露對作物幼苗脯氨酸含量的影響

圖4顯示，脯氨酸含量具有隨著碳納米管濃度的增高而增高的趨勢，MHCNTs與MCCNTs處理脯氨酸含量增加比較顯著，而MWCNTs處理在高濃度(500 mg/L)下脯氨酸含量明顯提高。MHCNTs與MWCNTs吸附HA后處理T4，T5，T6組脯氨酸平均含量明顯低于對照，不同濃度MCCNTs吸附HA后仍然維持較高水平，而且顯著高于未經(jīng)HA吸附的處理。

SWCNTs及其HA改性顆粒暴露下，不同處理的水稻和大豆幼苗脯氨酸含量具有顯著差異(見圖5)。在原樣SWCNTs暴露下3個處理的水稻幼苗脯氨酸含量比空白分別降低了17.0%、32.2%和24.1%。改性SWCNTs的3個處理的水稻幼苗脯氨酸含量比空白分別降低了31.2%、40.0%和30.9%。改性SWCNTs的3個處理的水稻幼苗脯氨酸含量均低于原樣SWCNTs的3個處理，其機(jī)理不明。

與水稻相反，大豆幼苗在原樣SWCNTs暴露下3個處理的脯氨酸含量比空白分別增加了16.7%、25.3%和9.5%。HA改性SWCNTs的3個處理的大豆幼苗脯氨酸含量比空白則分別增加了4.2%、4.6%和12.4%。HA改性SWCNTs處理的大豆幼苗脯氨酸含量比原樣SWCNTs處理有降低的趨勢(見圖5)。

圖6顯示，納米TiO2比納米ZnO暴露后，大豆幼苗脯氨酸含量有降低的趨勢，而納米顆粒吸附HA后，會緩解這種趨勢。納米TiO2與納米ZnO對大豆幼苗脯氨酸含量的影響并不顯著。

本研究中，納米顆粒脅迫導(dǎo)致脯氨酸含量下降，可能與供試材料抗逆性低有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

圖5 單壁碳納米管暴露對水稻及大豆幼苗脯氨酸含量的影響

圖6 TiO2和ZnO納米顆粒的暴露對大豆幼苗脯氨酸含量的影響

2.3 納米顆粒暴露對作物幼苗葉綠體色素含量的影響

圖7顯示，隨著碳納米管濃度的升高，葉綠素a的含量并無明顯變化。碳納米管吸附HA后葉綠素a的含量比碳納米管原樣的平均含量要高，MCCNTs處理葉綠素a含量低于CK，MHCNTs與MWCNTs處理葉綠素a含量的平均值則高于CK。隨著碳納米管濃度的升高，葉綠素b的含量的變化比較復(fù)雜。處理T4、T5、T6組加入HA后葉綠素b的含量平均值大于處理T1、T2、T3組，MCCNTs處理葉綠素b含量低于對照，MHCNTs與MWCNTs葉綠素b含量的均值則大于對照。隨著碳納米管濃度的升高，類胡蘿卜素的含量無顯著變化。

在原樣SWCNTs暴露下，隨著其濃度的升高，水稻幼苗葉綠體色素含量呈增加的趨勢(見圖8)。高濃度SWCNTs(R5)暴露下的水稻幼苗葉綠素a含量比CK高20.2%，葉綠素b含量比對照高出30.2%，類胡蘿卜素含量比對照高出14.8%。在HA改性SWCNTs暴露下，隨著HA濃度的升高，水稻幼苗葉綠體色素含量呈增加的趨勢，高濃度HA改性SWCNTs(R8)暴露下的水稻幼苗葉綠素a含量比對照高20.3%，葉綠素b含量比對照高出13.6%，類胡蘿卜素含量比對照高出18.2%。

在原樣SWCNTs暴露下，大豆幼苗3種葉綠體色素含量未呈現(xiàn)一致的變化趨勢(見圖8)。葉綠素a和類胡蘿卜素含量隨著濃度的升高，呈下降的趨勢；而葉綠素b含量則呈上升的趨勢。HA改性SWCNTs

圖7 多壁碳納米管暴露對水稻幼苗葉綠體色素含量的影響Ca：葉綠素a；Cb：葉綠素b；Cx.c：類胡蘿卜素

圖8 單壁碳納米管暴露對水稻幼苗葉綠體色素含量的影響Ca：葉綠素a，Cb：葉綠素b，Cx.c：類胡蘿卜素

暴露下，隨著HA濃度的升高，葉綠素a與葉綠素b含量則呈上升的趨勢，而類胡蘿卜素含量的變化無規(guī)律性，而且3個處理無顯著差異。HA改性SWCNTs的3個處理與原樣處理(S4)相比，會明顯提高葉綠素a和葉綠素b含量。

與對照相比，納米TiO2與納米ZnO暴露具有降低大豆幼苗葉綠素a含量的趨勢，但并不顯著(見圖9)。納米TiO2與納米ZnO暴露對葉綠素a含量沒有顯著差異。結(jié)果表明，納米TiO2與納米ZnO暴露導(dǎo)致大豆幼苗葉綠素a的降解，而且納米TiO2與納米ZnO吸附HA后，并沒有緩解這個趨勢。與CK相比，納米TiO2與納米ZnO暴露明顯降低了大豆幼苗葉綠素b含量；納米TiO2比納米ZnO對大豆幼苗葉綠素b含量的影響更為明顯。納米顆粒吸附HA后對納米顆粒的毒性有緩解作用。圖9顯示，納米顆粒暴露具有降低葉綠素(a、b)的趨勢，引起葉綠素的降解。與CK相比，納米TiO2與納米ZnO暴露具有提高大豆幼苗類胡蘿卜素含量的趨勢，TiO2納米顆粒比ZnO納米顆粒的影響表現(xiàn)的尤為明顯。納米顆粒吸附HA后的表現(xiàn)有點(diǎn)復(fù)雜，納米ZnO的作用比納米TiO2的作用似乎相反，其影響機(jī)制缺乏規(guī)律性，有待于進(jìn)一步研究。

圖9 TiO2和ZnO納米顆粒暴露對大豆幼苗葉綠體色素含量的影響(mg/g)Ca：葉綠素a，Cb：葉綠素b，Cx.c：類胡蘿卜素

2.4 相關(guān)性分析

在MWCNTs及MHCNTs暴露下，脯氨酸含量具有隨著MDA含量增加而增加的趨勢，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.494及r=0.702，相關(guān)不顯著。在MCCNTs暴露下，脯氨酸含量具有隨著MDA含量增加而降低的趨勢，相關(guān)系數(shù)為r=-0.506，相關(guān)不顯著。盡管相關(guān)不顯著，但水稻幼苗在納米脅迫下，具有抗性提高的趨勢。在SW暴露下，水稻和大豆幼苗的脯氨酸含量與MDA含量相關(guān)不顯著。

納米TiO2暴露下大豆幼苗MDA與脯氨酸的相關(guān)系數(shù)r=0.793，相關(guān)不顯著。納米ZnO暴露下大豆幼苗MDA與脯氨酸的相關(guān)系數(shù)r=0.608，相關(guān)不顯著。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。但是， 納米TiO2比納米ZnO暴露后脯氨酸含量反而有下降的趨勢，可能與大豆本身對納米顆粒脅迫的抵抗性有關(guān)。

3 討 論

目前，大量研究表明納米顆粒(NPs)對植物的毒性機(jī)制還很不確定[1]，主要致毒機(jī)制包括膜脂過氧化導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性破壞、葉綠體及線粒體等細(xì)胞器損傷，氧化脅迫還會引起蛋白質(zhì)和核酸變性基因毒性等[13]，這些致毒機(jī)制可能與NPs 的本身的表面理化特征有關(guān)。

本研究中，碳納米管和金屬氧化物納米顆粒暴露均會導(dǎo)致作物幼苗MDA含量呈增加的趨勢，表明納米顆粒暴露會產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致膜脂過氧化，對細(xì)胞造成一定程度的損傷。但是脯氨酸含量隨著納米顆粒種類及其劑量的變化并沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性，而且與MDA含量相關(guān)不顯著，表明脯氨酸含量的增減可能與膜脂過氧化無關(guān)。植物體內(nèi)抗氧化機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

隨著碳納米管濃度的增高，丙二醛(MDA)含量逐漸增高，且隨之加入胡敏酸后丙二醛的含量明顯減少。水稻幼苗在碳納米管暴露下膜脂過氧化嚴(yán)重，因此對水稻幼苗有毒性效應(yīng)。隨著碳納米管濃度的增加，水稻幼苗(MWCNTs及MHCNTs暴露下)和大豆幼苗(SWCNTs暴露下)脯氨酸濃度明顯增加，呈上升趨勢，表明其對納米毒性具有的一定抵抗能力。多壁碳納米管暴露下葉綠體色素含量呈降低的趨勢，尤其是葉綠素a和葉綠素b可能發(fā)生降解。本研究證實(shí)了金屬氧化物納米顆粒暴露會引起膜脂過氧化，導(dǎo)致生物膜系統(tǒng)受損。納米TiO2和納米ZnO暴露下大豆幼苗內(nèi)丙二醛(MDA)含量顯著提高，表明納米顆粒暴露導(dǎo)致膜脂過氧化，對植物造成嚴(yán)重傷害。納米TiO2和納米ZnO暴露具有導(dǎo)致葉綠素a、葉綠素b及脯氨酸含量下降的趨勢。本研究還不足以闡明水稻與大豆幼苗對納米脅迫的防御機(jī)制，需深入研究揭示植物對氧化脅迫的適應(yīng)與防御機(jī)制。