李新宇 何利明 詹亞光,2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

WRKYs轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中共發(fā)現(xiàn)了74個基因[1]，在水稻(Oryzasativa)中有109個成員[2]。每個WRKY轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域中都至少含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是一段大約60個氨基酸所組成的多肽序列，在其氨基(N)末端含有由WRKYGQK7個氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域。在其羧基(C)末端有一個鋅指結(jié)構(gòu)[3～4]。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和其鋅指結(jié)構(gòu)的組成可以將WRKY家族分為3個亞家族。第一類(Ⅰ)一般含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域，但只有C末端行使功能，N段的WRKY結(jié)構(gòu)域輔助C端的結(jié)構(gòu)域行使作用。其鋅指結(jié)構(gòu)的組成為CX4-5CX22-23HXH(X為非保守氨基酸)。第二類(Ⅱ)只含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)仍為CX4-5CX22-23HX1H。第三類(Ⅲ)也只含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域。但其鋅指結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，為CX7CX23HX1C。不同的WRKY亞家族有著不同的與DNA的結(jié)合能力，在進(jìn)化上也是從第一類亞家族進(jìn)化到第二、三類亞家族[5～7]。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控是通過細(xì)胞或生物有機(jī)體來控制基因表達(dá)的重要機(jī)制。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在調(diào)控植物應(yīng)對非生物脅迫的響應(yīng)中起重要作用[8]。最近研究中，過表達(dá)的轉(zhuǎn)ZmWRKY106基因玉米植株提高了對干旱和高溫脅迫的耐受性[9]，菊花DgWRKY2基因可以增強(qiáng)其對鹽脅迫的耐受性[10]，虎杖PcWRKY33可以增加細(xì)胞的活性氧(ROS)水平來降低耐鹽性[11]，水稻OsWRKY71應(yīng)對冷害脅迫中起重調(diào)控作用[12]，黃瓜CsWRKY46通過ABA信號使轉(zhuǎn)基因植株抗寒[13]。最新研究還顯示擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtWKRY13能激活PDR8表達(dá)正向調(diào)節(jié)其對鎘的抗性[14]。同時大量的研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物對非生物脅迫的應(yīng)答，同時也參與調(diào)控植物的激素信號通路以及生長發(fā)育。如轉(zhuǎn)錄因子WRKY18、WRKY40和WRKY60參與擬南芥對ABA信號的響應(yīng)[15]。AtWRKY39可以被SA或MeJA誘導(dǎo)[16]，并協(xié)同參與SA和JA信號通路，基因OsWRKY24，OsWRKY53和OsWRKY70對劑量依賴性調(diào)節(jié)GA和ABA信號傳導(dǎo)的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑起作用[17]，AtWRKY75可以調(diào)節(jié)DELLA蛋白促進(jìn)擬南芥開花[18]。

水曲柳是我國東北地區(qū)主要的造林樹種和品質(zhì)優(yōu)良的用材樹種，能在-40℃下存活，在抗寒方面有著優(yōu)良的基因資源[19]，在改良植物抗寒性的基因工程的應(yīng)用上有巨大潛力。目前，關(guān)于水曲柳基因報道較少，對抗逆相關(guān)的WRKYs轉(zhuǎn)錄因子的報道也僅有一例[20]。為此，本研究從水曲柳轉(zhuǎn)錄組中克隆了FmWKRY44基因，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，探索了該基因在不同組織中以及不同激素和非生物脅迫下的表達(dá)特點，為水曲柳抗寒基因資源的利用奠定了一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

Takara植物RNA提取試劑盒(9767)，Takara LATaq(RR02MQ)，Takara DL2000 Marker，全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AH311)，全式金定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AH341)，Takara SYBR Green定量試劑盒(RR802A)，OMEGA瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

使用Takara植物RNA提取試劑盒(9767)提取水曲柳葉片總RNA。用1%瓊脂糖檢測所提取RNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。使用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AH311)進(jìn)行cDNA第一鏈合成。

1.2.2 引物設(shè)計及目的基因克隆

參照水曲柳基因轉(zhuǎn)錄組序列，設(shè)計FmWRKY44基因特異性引物(FmWRKY44-F：5′-TTTGCCTTCGACACTTCTCA-3′，F(xiàn)mWRKY44-R：5′-GGAAGTCAGTTCCTTGAGTGT-3′)。進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)體系：10×LATaqBufferⅡ 2 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1each)1.6 μL，F(xiàn)mWRKY44-F(10 pmol·μL-1)1 μL，F(xiàn)mWRKY44-R(10 pmol·μL-1)1 μL，水曲柳cDNA 1 μL，LATaq(5 units·μL-1)0.4 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，50～55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取2 μL PCR產(chǎn)物，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。確認(rèn)目的條帶后，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶，并用瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收?；厥债a(chǎn)物鏈接pEASY-T5載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜，選取陽性結(jié)果菌液，送至上海生物工程有限公司測序驗證。

1.2.3 FmWRKY44的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用NCBI ORF Finder在線軟件分析查找基因的開放閱讀框。利用DNAMAN軟件對因的cDNA序列進(jìn)行分析，并推測得到其蛋白質(zhì)編碼氨基酸序列。使用在線分析軟件Protparain對蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。使用在線分析軟件ProtScale對蛋白進(jìn)行親水性/疏水性分析。使用在線分析工具SignalP的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對蛋白進(jìn)行信號肽的預(yù)測和分析。使用在線工具TMPred對蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析。利用SOPMA在線工具分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成。與NCBI上其他物種同源蛋白序列進(jìn)行比對分析，然后使用MEGA7軟件，構(gòu)建進(jìn)化樹。使用在線多序列比對軟件PRALINE(http://www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/)對蛋白與其它不同物種中同源蛋白序列進(jìn)行詳細(xì)的多序列比對分析。使用SMART在線分析軟件對WRKY44蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。

1.2.4 實驗材料及處理

本研究所用的組織材料為本實驗室培養(yǎng)的水曲柳愈傷組織和水曲柳種子組培培養(yǎng)30 d的幼苗。根、莖、葉取自水曲柳3年生盆栽苗。按照表1中處理方法對實驗材料進(jìn)行處理。

表1 實驗材料處理方法及處理時間

1.2.5 實時熒光定量分析

以水曲柳種子、愈傷組織、根、莖、葉和組培苗作為材料，應(yīng)用RNA提取試劑盒(minibest，9769)提取總RNA。應(yīng)用全式金qRT-PCR試劑盒(AH341)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以F:5′-GGGAGGGACAACCTTATTCG-3′;R:5′-CCTTTGACTTGCTTCTGACCAT-3′為FmWRKY44引物，以FmTu(F:5′-AGGACGCTGCCAACAACTTT-3′;R:5′-TTGAGGGGAAGGGTAAATAGTG-3′)為內(nèi)參基因。采用ABI PRISM7500實時熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行基因表達(dá)分析。反應(yīng)體系：模板cDNA 1 μL(10 ng·μL-1)，2×SYBR Premix ExTaq10 μL,Rox reference DyeⅡ 0.4 μL,primer F 0.8 μL,primer R 0.8 μL,加水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 35 s進(jìn)行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，計算FmWRKY44基因相對表達(dá)量。每個取樣點設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，qRT-PCR設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。

圖1 FmWRKY44基因的RT-PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果 M.DL2000 DNA maker；1.FmWRKY44基因Fig.1 RT-PCR amplification electrophoresis results of FmWRKY44 gene M.DL2000 DNA maker；1.FmWRKY44 gene PCR product

2 結(jié)果與分析

2.1 FmWRKY44基因克隆與序列分析

以水曲柳葉片為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得一條長為1 383 bp的序列(圖1)。經(jīng)BLAST比對分析，該序列與樟子松WRKY基因(XM_023033499.1)一致性為91%。經(jīng)DNAMAN翻譯，該序列編碼460個氨基酸。通過在線分析軟件SMART對FmWRKY44蛋白分析，并繪制其結(jié)構(gòu)域的位置圖。結(jié)果表明，F(xiàn)mWRKY44在185～243位置和381～440位置共有兩個WKRY保守結(jié)構(gòu)域。所以推測其屬于WRKY家族中的Ⅰ類蛋白質(zhì)亞家族(圖2)。

圖2 FmWRKY44基因編碼區(qū)的核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列 下橫線表示W(wǎng)RKY超家族結(jié)構(gòu)域。Fig.2 Nucleotide sequence of the coding region of FmWRKY44 gene and its deduced amino acid sequence The lower horizontal line indicates the WRKY superfamily domain.

2.2 FmWRKY44編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 FmWRKY44蛋白一級結(jié)構(gòu)分析

利用ProtParam工具在線分析，F(xiàn)mWRKY44編碼460個氨基酸，分子式為C2190H3477N645O717S15，相對分子質(zhì)量50.80 kD，等電點(pI)8.88，不穩(wěn)定系數(shù)38.62，為穩(wěn)定蛋白，平均親水系數(shù)(GRAVY)-0.878，為親水蛋白。利用ProtScale計算FmWRKY44親疏水性圖譜，結(jié)果顯示FmWRKY44蛋白中疏水氨基酸占20.4%，親水氨基酸占87.4%，親水區(qū)域分布面廣，所占比高；疏水區(qū)域較少，所占比低。表明FmWRKY44蛋白為親水蛋白(圖3A)。利用SignalP4.1 Server和TMPred分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mWRKY44沒有跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域(圖3B)，未發(fā)現(xiàn)信號肽結(jié)構(gòu)，推斷該蛋白為非分泌蛋白，表明蛋白在細(xì)胞質(zhì)中合成后不能被轉(zhuǎn)運(yùn)。利用WOLFPSORT預(yù)測FmWRKY44亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，F(xiàn)mWRKY44主要分布在細(xì)胞核中，占78.3%，細(xì)胞質(zhì)、線粒體和過氧化物酶體分別占8.7%、8.7%和4.3%。

2.2.2 FmWRKY44蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA在線工具分析FmWRKY44蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果顯示蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由70.22%(323aa)的無規(guī)則卷曲，16.30%(77aa)的α螺旋結(jié)構(gòu)(Alpha helix)，10.22%(47aa)的擴(kuò)展長鏈(Extended strand)，3.26%(15aa)的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(Beta bridge)構(gòu)成(圖4)。

2.2.3 FmWRKY44蛋白的活性位點分析

利用PROSCAN在線分析工具對FmWRKY44蛋白進(jìn)行活性位點分析，結(jié)果表明該蛋白包括4個N-糖基化位點，6個蛋白激酶C磷酸化位點，10個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，4個N-豆蔻?；稽c。

圖3 水曲柳FmWRKY44蛋白的親/疏水性(A)、跨膜區(qū)域(B)分析預(yù)測Fig.3 Analysis of pro-/hydrophobic(A) and transmembrane region(B) of FmWRKY44 protein

圖4 水曲柳FmWRKY44蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 橫軸表示氨基酸位置；藍(lán)色表示α螺旋；綠色表示β轉(zhuǎn)角；紫色表示無規(guī)則卷曲；紅色標(biāo)會延伸鏈Fig.4 Prediction of secondary structure of FmWRKY44 protein The horizontal axis represents the amino acid position; the blue represents the alpha helix; the green represents the beta turn; the purple represents the random curl; the red marker extends the chain

圖5 不同植物WRKY44蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis of WRKY44 from different plants

2.2.4 FmWRKY44蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA7.0.2中的NJ方法構(gòu)建蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示數(shù)水曲柳FmWRKY44與芝麻SiWRKY44[21]親緣關(guān)系較近(圖5)。

2.3 FmWRKY44同源蛋白的多序列比對分析結(jié)果

利用在線多序列比對軟件PRALINE對FmWRKY44蛋白序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中一些其它物種的WRKY44蛋白序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，F(xiàn)mWRKY44與其它WRKY44蛋白序列的保守區(qū)主要集中在2個WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)為CX4～5CX22～23HXH(X為非保守氨基酸)，與前人研究相符合(圖6)。

2.4 FmWRKY44的表達(dá)特性

以水曲柳種子、葉、葉柄、根、莖和愈傷分別為模板，通過qRT-PCR檢測分析FmWKRY44在水曲柳不同部位的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示FmWKRY44在種子中高度表達(dá)，是葉片表達(dá)量的4.83倍(圖7A)。

為了分析水曲柳FmWRKY44對非生物脅迫的表達(dá)模式，我們分析了低溫、高溫、100 mmol·L-1NaCl和10%PEG-6000逆境條件下FmWKRY44的表達(dá)情況。在低溫脅迫下FmWRKY44基因表達(dá)量在0～12 h基本持平，在24 h達(dá)到最高，為0 h表達(dá)量的2.61倍，隨后表達(dá)量降低，在96 h達(dá)到最低，為0 h表達(dá)量的0.41倍(圖7B)。在高溫脅迫下，F(xiàn)mWRKY44表達(dá)量在0.5 h時立即下降，其表達(dá)量為0 h表達(dá)量的0.23倍，隨后1～2 h內(nèi)逐漸上升(圖7C)。在NaCl鹽脅迫下，F(xiàn)mWRKY44在0～6 h內(nèi)基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升在下降的趨勢，3 h表達(dá)量達(dá)到最高并為0 h表達(dá)量的1.78倍，12 h基因表達(dá)量恢復(fù)并持平(圖7D)。PEG模擬干旱處理下，F(xiàn)mWRKY44基因表達(dá)量在12和72 h出現(xiàn)峰值分別是0 h表達(dá)量的1.98和1.66倍，其他時間較0 h表達(dá)量降低(圖7E)。由此，F(xiàn)mWRKY44基因可以參與低溫、高溫、高鹽以及干旱非生物脅迫影響的響應(yīng)，且高度響應(yīng)低溫、高溫逆境。

為了分析水曲柳FmWRKY44對不同激素的響應(yīng)情況，我們用激素NAA、ABA、GA3、JA處理水曲柳實生苗分析其FmWRKY44基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在NAA處理下FmWKRY44基因表達(dá)量在0～24 h內(nèi)FmWRKY44基因表達(dá)量降低，在6 h達(dá)到最低峰值，其表達(dá)量是0 h表達(dá)量的0.29倍，在72 h是表達(dá)量升高并達(dá)到最高峰值，為0 h表達(dá)量的2.08倍(圖7F)。ABA處理下FmWRKY44基因表達(dá)量在13和12 h出現(xiàn)峰值分別是0 h表達(dá)量的1.96和1.65倍，其他時間較0 h表達(dá)量降低(圖7G)。GA3處理下前1～6 h內(nèi)FmWRKY44基因表達(dá)量降低，12～72 h表達(dá)量逐漸升高，72 h達(dá)到峰值，其表達(dá)量是0 h表達(dá)量的1.3倍(圖7H)。JA處理下FmWRKY44基因表達(dá)量在1～24 h較低，在72 h時表達(dá)升高并達(dá)到最高峰值，其表達(dá)量是0 h表達(dá)量的1.64倍(圖7I)。因此，F(xiàn)mWRKY44基因可以響應(yīng)NAA、ABA、GA3、JA信號。

圖6 FmWRKY44與其它植物WRKY蛋白序列比對 粗線表示W(wǎng)RKY結(jié)構(gòu)域；箭頭表示鋅指結(jié)構(gòu)Fig.6 Multiple-alignment of FmWRKY44 with other WRKY proteins Thick lines indicate WRKY domains;Arrows indicate zinc finger structures

圖7 水曲柳不同組織及不同處理下FmWRKY44表達(dá)分析 A.不同組織部位；B.低溫處理；C.高溫處理；D.NaCl處理；E.PEG處理；F.NAA處理；G.ABA處理；H.GA3處理；I.JA處理Fig.7 Expression analysis of FmWRKY44 in different tissues and different treatments A. Different tissue parts; B. Low temperature treatment; C. High temperature treatment; D. NaCl treatment; E. PEG treatment; F. NAA treatment; G. ABA treatment; H. GA3 treatment; I. JA treatment

3 討論

干旱、高鹽、低溫、高溫等極端條件，是植物生長過程中所面臨的的主要逆境非生物脅迫因素。在逆境條件下，許多植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子家族如WRKY、AP2/ERF和NAC等，它們在植物的生長抗逆調(diào)節(jié)控制中起著重要而獨(dú)特的作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是其中發(fā)現(xiàn)較早的一種轉(zhuǎn)錄因子，其主要結(jié)構(gòu)是所包含的WRKY結(jié)構(gòu)域[22]，是具有60個氨基酸長的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，特征在于N端具有一個高度保守的WRKYGQK核心基序，根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)的類型[8,23]，可以區(qū)分WRKY轉(zhuǎn)錄因子的類型。本研究獲得FmWRKY44基因，發(fā)現(xiàn)該基因含有2個WRKY保守結(jié)構(gòu)域，且鋅指結(jié)構(gòu)符合CX4-5CX22-23HXH結(jié)構(gòu)，通過保守域和與其他物種WRKY44蛋白序列比較分析證明該基因?qū)儆诘谝活怶RKY家族。

在植物脅迫反應(yīng)中，WRKY蛋白促進(jìn)了植物復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)的建立和在植物非生物脅迫反應(yīng)中重要作用的WRKY蛋白使?jié)撛诘幕虬l(fā)揮傳遞逆境脅迫的作用[24～25]。先前研究發(fā)現(xiàn)植物受到逆境脅迫時，胞外信號MAPK激酶等逐級傳遞調(diào)控信號進(jìn)入胞內(nèi)，激活WRKY及其他轉(zhuǎn)錄因子與下游靶基因結(jié)合[26～27]，并在ABA、SA、JA、ET以及其他WRKY轉(zhuǎn)錄因子等信號途徑的調(diào)控下，在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)該基因的表達(dá)，從而影響植物非生物脅迫應(yīng)答[28]。本研究通過測定30天組培苗在低溫、高溫、鹽和干旱條件下的基因表達(dá)量，分析發(fā)現(xiàn)FmWRKY44可以受到溫度調(diào)節(jié)，并低溫促進(jìn)其表達(dá)，高溫抑制其表達(dá)FmWRKY44，并對鹽、干旱脅迫也有劇烈響應(yīng)。植物內(nèi)源激素如ABA、SA、JA、ET等不僅參與脅迫反應(yīng)，而且還在植物生長發(fā)育、種子發(fā)育及衰老等一系列生命活動期中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。所以我們進(jìn)一步測定了FmWRKY44在NAA、ABA、GA3、JA處理下的表達(dá)水平。分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mWRKY44在NAA、GA3和JA處理下都基本呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，說明FmWRKY44可能受3種激素負(fù)向調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn)FmWRKY44在種子中的表達(dá)水平，遠(yuǎn)高于在其他器官中的表達(dá)水平是其在葉片表達(dá)量的4.83倍，說明FmWRKY44積累對于種子萌發(fā)與休眠過程起到重要作用。此外，ABA信號對種子萌發(fā)，以及應(yīng)對干旱等非生物脅迫有著重要作用?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)許多WRKY轉(zhuǎn)錄因子如AtWKRY43[29]、ZmWRKY40[30]均響應(yīng)ABA信號，進(jìn)而調(diào)控種子萌發(fā)和應(yīng)對高鹽、干旱和低溫脅迫。AtWRKY44在干旱脅迫下受GI-miRNA172信號響應(yīng)，并進(jìn)一步實驗分析認(rèn)為其響應(yīng)過程可能是干旱使得ABA水平增加，進(jìn)而激活級聯(lián)響應(yīng)[31]。在本研究中FmWKRY44對ABA、干旱、鹽、低溫以及種子萌發(fā)過程中均有劇烈響應(yīng)，說明其可能也參與ABA信號通路，但其具體作用機(jī)制仍不明確，仍需未來進(jìn)行實驗驗證及討論分析。