王麗君 朱書(shū)強(qiáng) 周佳

摘要 [目的]建立一種簡(jiǎn)單、快捷測(cè)定調(diào)味油中工業(yè)染料羅丹明B的方法。[方法]樣品經(jīng)甲醇超聲提取，高速離心，上清液經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾后進(jìn)高效液相色譜C18柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)。[結(jié)果]羅丹明B在5～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9），檢出限為5 μg/kg，回收率為89.2%～93.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%（n=6）。[結(jié)論]該法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于調(diào)味油中非法添加物羅丹明B含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 羅丹明B;調(diào)味油;高效液相色譜;C18柱;熒光檢測(cè)

中圖分類號(hào) TS 207.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）12-0210-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.058

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective] The study established a simple and quick determination method of the industrial dye rhodamine B in flavoring oil. [Method] The sample was extracted with methanol ultrasonic and high speed centrifugation. The upper cleaning liquid was filtered by 0.22 μm membrane and then separated by high performance liquid chromatography C18 column， and the fluorescence detector was detected. [Result] The results showed that rhodamine B had good relationship between 5-500 ng/mL （correlation coefficient R2=0.999 9）， and the detection limit was 5 μg/kg， and the recovery rate was 89.2%-93.5%. The relative standard deviation was 1.7%（n=6）. [Conclusion] The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the determination of the content of illegally added rhodamine B in flavoring oil.

Key words Rhodamine B;Seasoning oil;HPLC;C18 column;Fluorescence detection

羅丹明B（Rhodamine B）又稱玫瑰紅B或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅，是一種具有鮮桃紅色的人工合成染料，易溶于水、乙醇[1]。羅丹明B具有價(jià)格低廉、色澤紅艷、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，常用作增加顏色的食品添加劑，但后來(lái)試驗(yàn)證明羅丹明B會(huì)致癌，已被禁止用作食品染色[2-5]。經(jīng)市場(chǎng)走訪調(diào)查，一些商販為了節(jié)約成本，低價(jià)收購(gòu)一些劣質(zhì)的辣椒、花椒、芥末等原料加工成花椒油、辣椒油、芥末油，為了改變產(chǎn)品的賣相，往往添加羅丹明B來(lái)提高其紅艷度，以次充好欺騙消費(fèi)者。羅丹明B的檢測(cè)常用中性氧化鋁固相萃取小柱進(jìn)行前處理凈化，但要控制中性氧化鋁小柱的活性，操作步驟比較繁瑣，回收率也無(wú)法保證。當(dāng)前檢測(cè)食品中羅丹明B的方法只有SN2430—2010，該方法需要過(guò)凝膠固相色譜，前處理消耗有機(jī)溶劑量比較大，分析時(shí)間長(zhǎng)，試驗(yàn)成本高，不能被廣泛應(yīng)用。筆者對(duì)調(diào)味油中的羅丹明B采用純甲醇提取，高效液相色譜分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便，特異性和回收率高，適合調(diào)味油的定量分析[6-12]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品為市售辣椒油、芥末油、花椒油等。試劑：甲醇，色譜純，純度>99.99%，賽默飛世爾科技有限公司;羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀配2475熒光檢測(cè)器，美國(guó)沃特世公司;湘儀1200型離心機(jī)，德國(guó)BECKMAN COULTER公司;電子天平，感量為0.1 g和0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）有限公司;YQ-1002C型超聲波清洗器，上海易凈超聲波儀器有限公司;MT/VORTEX型旋渦混勻器，上海五相儀器儀表有限公司;容量瓶：規(guī)格10、25 mL等，泰州市和順玻璃制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法。稱取2.0 g樣品（精確至0.01 g）于25 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲提取15 min后，用甲醇定容。高速離心5 min，取上清液過(guò) 0.22 μm 微孔濾膜后經(jīng)高效液相色譜分析。

1.3.2 色譜條件。色譜柱：C18柱4.6 mm×250 mm，5 μm;流動(dòng)相：甲醇+水（70∶30，V/V）;流速：1.0 mL/min;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10 μL;激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（Em）580 nm[13]。

1.3.3 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10.0 mg羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL的容量瓶中，用甲醇配制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～4 ℃避光保存。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用甲醇稀釋成5.0、10.0、20.0、50.0、500.0 ng/mL備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑對(duì)樣品檢測(cè)的影響

文獻(xiàn)[14-20]報(bào)道，調(diào)味品大多采用乙酸乙酯和環(huán)己烷提取。筆者采取水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯-環(huán)己烷（體積比1∶1）作為提取溶劑，在辣椒油中分別加入0.5、1.0、4.0 mL 50 ng/mL 的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3.1”的方法進(jìn)行提取并測(cè)定其含量，計(jì)算回收率。由表1可知，當(dāng)采用甲醇作為提取溶劑時(shí)，回收率最高。因此，該試驗(yàn)采用甲醇作為提取溶劑。

2.2 流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

比較了水-甲醇及水和乙腈體系不同配比對(duì)羅丹明B測(cè)定的影響，結(jié)果表明，當(dāng)采用甲醇-水（30∶70，V/V）作為流動(dòng)相時(shí)，羅丹明B峰形尖銳，不拖尾（圖1），且流動(dòng)相配比簡(jiǎn)單，方便快捷。根據(jù)《進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)方法》確定了羅丹明B的激發(fā)波長(zhǎng)Ex=550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=580 nm。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用上述優(yōu)化的色譜條件對(duì)羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析檢測(cè)，以羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，羅丹明B的線性回歸方程為y=32.467 x+0.096，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 9，檢出限為5 μg/kg，RSD為1.7%。

羅丹明B在5～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。說(shuō)明該方法線性范圍寬，適合不同濃度樣品的分析。按3倍的信噪比計(jì)算得出，該方法的檢出限為5.0 μg/kg。

2.4 精密度試驗(yàn)

取10 ng/mL 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品，按上述優(yōu)化的方法平行測(cè)定6次，結(jié)果分別為9.73、9.68、9.66、9.98、9.80、9.77 ng/mL，RSD為1.7%。

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品的RSD<3%，符合方法驗(yàn)證精密度要求。

2.5 回收率及重現(xiàn)性試驗(yàn)

將空白辣椒油、花椒油、芥末油按照上述的方法處理后，分別添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度為0.2、0.5、2.0 mg/kg，每個(gè)樣同一濃度做6個(gè)平行樣，結(jié)果見(jiàn)表2～4。由表2～4可見(jiàn)，該方法具有較高的準(zhǔn)確度和可靠性。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

按照上述方法對(duì)在本地區(qū)購(gòu)買的150批次的辣椒油、芥末油、花椒油進(jìn)行提取，并采用高效液相色譜-熒光法測(cè)定，均未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品。

3 結(jié)論

建立了一種快速、簡(jiǎn)便的測(cè)定調(diào)味油中羅丹明B的方法。樣品經(jīng)純甲醇超聲提取后，高速渦旋、離心，有機(jī)膜過(guò)濾，用高效液相色譜C18柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)。實(shí)際測(cè)定結(jié)果表明，該方法前處理步驟簡(jiǎn)單，提取率高，重現(xiàn)性好，適用于調(diào)味油中羅丹明B的定量分析。

參考文獻(xiàn)

[1] 徐聲樂(lè)，王興，劉金萍，等.羅丹明B及其在食品中檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2015，36（17）：136-139.

[2] 韋娜.拉曼光譜法檢測(cè)辣椒制品中羅丹明B和摻兌地溝油的花生油[D].沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[3] 晏嫣，康學(xué)軍.食品中色素的前處理-羅丹明B 的檢測(cè)[C]//中國(guó)化學(xué)會(huì)第六屆全國(guó)儀器分析及樣品預(yù)處理學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.北京：中國(guó)化學(xué)會(huì)，2012：249-250.

[4] 許麗梅，康靖，曾勇明，等.SERS技術(shù)應(yīng)用于食品中羅丹明B的快速檢測(cè)[J].食品工業(yè)科技，2017，38（24）：238-242，247.

[5] 盧士英，鄒明強(qiáng).食品中常見(jiàn)的非食用色素的危害與檢測(cè)[J].中國(guó)儀器儀表，2009（8）：45-50.

[6] 喬海鷗，胡佳薇，王敏娟.高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定辣椒及花椒制品中的羅丹明B[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014（5）：641-643，646.

[7] 林純忠，王韋達(dá)，陳美婷，等.低共熔溶劑萃取熒光法快速檢測(cè)辣椒油中的羅丹明B[J].科技與創(chuàng)新，2017（21）：32-33.

[8] 汪敏，江生，毛慶，等.調(diào)味品中違禁添加的非食用色素檢測(cè)技術(shù)綜述[J].中國(guó)調(diào)味品，2016，41（11）：152-155，158.

[9] 陳溫嫻，王朝瑾.非食品添加劑的檢測(cè)方法研究進(jìn)展-吊白塊和硼酸[J].分析化學(xué)，2009，37（A03）：357.

[10] 衛(wèi)生部發(fā)布被濫用的食品添加劑及非法添加物名單[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)會(huì)計(jì)，2011（6）：60-62.

[11] 張儉波.解析：食品添加劑、食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑擴(kuò)大使用范圍違法添加非食用物質(zhì)名單新資源食品[J].中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2010（1）：52-54.

[12] 曲雙雙，肖光輝，劉婷，等.UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中的壬基酚和雙酚A[J].中國(guó)食品添加劑，2016（8）：185-190.

[13] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)方法 高效液相色譜質(zhì)譜法：SN/T 2430—2010[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[14] 林清荷，陳鑫，吳忠興.辣椒粉中羅丹明B液相色譜檢測(cè)方法的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2012（11）：157-158.

[15] 咸瑞卿，高文超，王小兵，等.調(diào)味品中羅丹明B的HPLC-FLD-DAD測(cè)定方法研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2013，38（8）：109-112.

[16] 韋娜，王煜，張孝芳，等.辣椒制品中羅丹明B的基質(zhì)固相分散提取條件優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，33（3）：275-281.

[17] 陳艷美，于淼.羅丹明B染色食品對(duì)人體的危害及檢測(cè)[J].科學(xué)之友，2011（18）：153，157.

[18] YAN S C，LI Z S，ZOU Z G.Photodegradation of rhodamine B and methyl orange over borondoped gC3N4 under visible light irradiation[J].Langmuir，2010，26（6）：3894-3901.

[19] 殷居易，李佐卿，謝東華，等.凝膠凈化-高效液相色譜法檢測(cè)對(duì)位紅在辣椒醬和辣醬油中的殘留量[J].分析化學(xué)，2006，34（6）：867-870.

[20] 湯建春，龍朝陽(yáng)，許秀敏，等.高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定辣椒油、辣椒粉、火鍋底料中的羅丹明B染料[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（12）：2843-2844.