劉秀珍，彭慶文 ，張 冰，王蘊(yùn)紅

自2008年北京奧運(yùn)會(huì)以來(lái)，伴隨全民健身熱潮的急劇升溫，馬拉松運(yùn)動(dòng)逐漸成為健身新時(shí)尚，已經(jīng)發(fā)展成為國(guó)內(nèi)外辦賽最多、參賽人員規(guī)模最大的賽事項(xiàng)目。但是馬拉松運(yùn)動(dòng)也是一項(xiàng)高風(fēng)險(xiǎn)的耐力項(xiàng)目，跑馬選手在比賽中猝死的事故頻發(fā)。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，在馬拉松等耐力性項(xiàng)目比賽中，運(yùn)動(dòng)員發(fā)生猝死的2個(gè)重要原因是心律失常和勞力性熱射病，并且勞力性熱射病死亡比心律失常死亡更為普遍[1]。國(guó)內(nèi)研究表明，在馬拉松等耐力性項(xiàng)目比賽中，發(fā)生猝死的運(yùn)動(dòng)員均為既往體健，且多有運(yùn)動(dòng)習(xí)慣者，因此，跑馬拉松死亡的原因并不能簡(jiǎn)單用體質(zhì)好壞或有無(wú)運(yùn)動(dòng)鍛煉習(xí)慣來(lái)衡量，運(yùn)動(dòng)誘發(fā)勞力性熱射病是馬拉松等耐力運(yùn)動(dòng)員發(fā)生猝死的重要原因[2-3]。勞力性熱射?。‥xertional heat stroke，EHS）是一種以核心溫度超過(guò)40.5℃和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征的致命性疾病[4]，它對(duì)運(yùn)動(dòng)員生命安全造成極大的挑戰(zhàn)，是運(yùn)動(dòng)員發(fā)生猝死的最常見(jiàn)原因[5]。由于其發(fā)病急，病情進(jìn)展快，30 min內(nèi)沒(méi)有得到快速降溫處理的患者發(fā)生多器官功能衰竭以及死亡的機(jī)率會(huì)顯著性增加[6]。因此，必須在運(yùn)動(dòng)現(xiàn)場(chǎng)對(duì)患者進(jìn)行快速冷卻，以確?；颊叽婊睢?/p>

勞力性熱射病患者除了出現(xiàn)體溫過(guò)高以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙外，還會(huì)發(fā)生脫水、電解質(zhì)紊亂、橫紋肌溶解、急性腎衰竭、急性肝損傷、急性胃腸炎、鐮狀細(xì)胞特征、心律失常等多器官功能障礙[7]。其病理生理學(xué)機(jī)制涉及胃腸道炎癥變化、凝血功能異常、熱交換損傷、熱休克反應(yīng)、水鹽代謝失衡等方面，其中水鹽代謝失衡與體溫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。目前，國(guó)際上針對(duì)熱射病進(jìn)行冷卻治療的研究主要集中在冷療方法、冷療預(yù)案、過(guò)冷危險(xiǎn)等。其作用機(jī)制主要涉及替代性行使心血管體溫維護(hù)、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)熱損傷、減緩全身炎癥反應(yīng)和阻斷多器官功能障礙等方面。但是迄今為止，尚無(wú)冷卻治療對(duì)熱射病患者水鹽代謝調(diào)節(jié)方面的直接探索，冷卻治療通過(guò)水鹽代謝糾正水平衡和電解質(zhì)紊亂，進(jìn)而恢復(fù)體溫調(diào)節(jié)的病理生理學(xué)機(jī)制仍不十分清楚。冷卻治療在降溫的過(guò)程中，是否通過(guò)改變下丘腦抗利尿激素的合成與分泌來(lái)改善水代謝，進(jìn)而通過(guò)抗脫水途徑恢復(fù)下丘腦體溫調(diào)控作用并促進(jìn)熱射病病情轉(zhuǎn)歸的病理生理學(xué)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。因此，本文針對(duì)勞力性熱射病大鼠冷卻治療中下丘腦抗利尿激素AVPmRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)的的變化進(jìn)行研究，明確抗利尿激素在水代謝穩(wěn)態(tài)中的作用，為今后研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

51只7周齡雄性Sprague-Dawley大鼠，初始體重為（237.22±31.86）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011] 。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4只，自由飲水?dāng)z食，光照比為12 h：12 h，室內(nèi)溫度20～25℃，濕度45%～50%。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1天，隨機(jī)分為6組，常溫對(duì)照組（NC，n=8）、高溫運(yùn)動(dòng)即刻組（HE，n=9）、高溫運(yùn)動(dòng)休息1組（HER1，n=9）、高溫運(yùn)動(dòng)冷浸1組（HEC1，n=8）、高溫運(yùn)動(dòng)休息2組（HER2，n=9）、高溫運(yùn)動(dòng)冷浸2組（HEC2，n=8）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備

1.2.1 適應(yīng)性訓(xùn)練 高溫運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行為期5天的適應(yīng)性訓(xùn)練。跑臺(tái)坡度設(shè)置為0。訓(xùn)練強(qiáng)度為起始運(yùn)動(dòng)速度18 m/min，每天遞增2 m/min，最后達(dá)到26 m/min。訓(xùn)練時(shí)間為起始運(yùn)動(dòng)時(shí)間30 min，每天遞增10 min，最后達(dá)到60 min。適應(yīng)性訓(xùn)練安排見(jiàn)表1。

表1 大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練安排Table1 Adaptive Training Arrangement in Rats

1.2.2 高溫運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練后休息3天，再進(jìn)行一次性高溫力竭運(yùn)動(dòng)。高溫運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)在環(huán)境密閉的高溫高濕實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，高溫高濕溫度控制為（36±1）℃，濕度控制為75%±5%。大鼠運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度根據(jù)Bedford最大攝氧量表[8]及大鼠高溫運(yùn)動(dòng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定大鼠跑臺(tái)坡度為5度，速度為28 m/min，相當(dāng)于最大攝氧量60%～80%的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。大鼠熱射病診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)：（1）BOUCHAMA[9]經(jīng)典型熱射病狒狒模型：當(dāng)高溫應(yīng)激動(dòng)物直腸溫度上升到42.5℃標(biāo)志發(fā)生中度熱射病或動(dòng)脈收縮壓下降到90 mmHg以下即出現(xiàn)低血壓標(biāo)志發(fā)生重度熱射??；（2）LAM[10]經(jīng)典型熱射病大鼠模型：當(dāng)高溫應(yīng)激動(dòng)物直腸溫度上升到約42℃和平均動(dòng)脈壓從峰值下降到約25 mmHg標(biāo)志發(fā)生熱射?。唬?）CHANG[11]熱運(yùn)動(dòng)至力竭誘導(dǎo)勞力性熱射病大鼠模型及勞力性熱射病大鼠建模預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定勞力性熱射病大鼠模型為大鼠進(jìn)行熱運(yùn)動(dòng)至力竭，并使直腸溫度上升到約42℃。力竭標(biāo)準(zhǔn)為大鼠不能維持預(yù)定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，滯留于跑臺(tái)后擋板，使用聲、電刺激及毛刷連續(xù)驅(qū)趕3次無(wú)效。大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭后，快速測(cè)定直腸溫度并做記錄。

1.2.3 冷水浸泡實(shí)驗(yàn) 大鼠冷水浸泡方案根據(jù)：（1）MCDERMOTT[12]治療熱射病常用冷卻方式的冷卻速率；（2）RIANA[4]海軍陸戰(zhàn)隊(duì)馬拉松運(yùn)動(dòng)員勞力性熱射病冷卻措施；（3）STEWART[13]勞力性熱射病患者冷卻案例及大鼠冷水浸泡預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。本實(shí)驗(yàn)冷水浸泡溫度設(shè)定為19℃，實(shí)際溫度變化范圍為18～20℃。冷水浸泡時(shí)間設(shè)定為5 min。冷浸過(guò)程中大鼠如出現(xiàn)顫抖，應(yīng)考慮立即停止冷浸，并防止過(guò)冷。休息溫度設(shè)定為20℃，實(shí)際溫度變化范圍為19～21℃。在高溫運(yùn)動(dòng)至力竭后，HER1組大鼠休息5 min；HEC1組大鼠冷浸5 min；HER2組大鼠休息65 min（5 min+60 min）；HEC2組大鼠冷浸5 min，休息60 min。在60 min休息期間，每間隔10 min監(jiān)測(cè)一次大鼠直腸溫度。

1.3 取材及處理

各組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即采用10%水合氯醛按照0.32 mL/100 g體重的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉。冰上解剖大鼠，選取腹主動(dòng)脈進(jìn)行取血；摘取下丘腦后立即放入液氮中迅速冷凍及保存。

1.4 測(cè)試指標(biāo)與方法

1.4.1 血常規(guī) 采用日本光電工業(yè)株式會(huì)社全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（MEK-7222K，Japan）測(cè)試大鼠血常規(guī)，選取紅細(xì)胞壓積（Hematocrit，Hct）與血紅蛋白（hemoglobin，Hb）指標(biāo)進(jìn)行研究。試劑由上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司提供。

1.4.2 血激素 采用美國(guó)ThermoMK3酶標(biāo)儀（MK3，America）測(cè)試大鼠血液抗利尿激素（Arginine Vasopressin，AVP），測(cè)試方法為雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。大鼠抗利尿激素ELISA試劑盒由美國(guó)Enzolife公司提供。

1.4.3 RNA的提取和qRT-PCR檢測(cè) 采用熒光定量qRTPCR檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)試下丘腦AVPmRNA表達(dá)。取適量組織放入液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末并轉(zhuǎn)移到EP管中，用Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）試劑抽提總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找的相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物（見(jiàn)表2），采用EvaGreen飽和染料Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)（見(jiàn)圖1）[14]。根據(jù)各反應(yīng)孔的△CT值，運(yùn)用2-△△CT相對(duì)定量法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。用內(nèi)參GAPDH對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。1.4.4 蛋白的提取和Western Blot檢測(cè) （1）蛋白抽提：預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑（cocktail）；12 000 rpm（4度）離心15 min。取上清，進(jìn)行蛋白定量。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息Table2 The List of Primer in qRT-PCR

圖1 EvaGreen核酸染料經(jīng)由釋放點(diǎn)播機(jī)制結(jié)合到雙鏈DNAFigure1 EvaGreen Nucleic Acid Dyes are Linked to Double Stranded DNA Via Release-on-demand Mechanism

（2）BCA法蛋白定量：按照BCA蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明操作，測(cè)定蛋白濃度。

（3）Western Blot：將樣本分別加入凝膠孔中，30 ug/孔。采用濃縮膠恒壓電泳：90 V，約20 min；分離膠恒壓150 V，通過(guò)預(yù)染蛋白marker來(lái)確定電泳停止時(shí)間。采用濕式轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，60 min。5%BSA-TBST室溫封閉，水平搖床孵育1 h。一抗孵育：5%BSA-TBST稀釋一抗（AVP，1：2 000；GAPDH，1：1 000，Abcam公司），4℃水平搖床孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜：3×10 min。二抗孵育：5%BSA-TBST稀釋二抗（山羊抗兔IgG（H+L），HRP，1：10 000，Abcam公司），室溫孵育1 h。TBST洗膜：3×10 min。將ECL發(fā)光液滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3～5 min。膠片曝光：10 s～5 min（曝光時(shí)間隨不同光強(qiáng)度而調(diào)整），顯影2 min，定影。

（4）計(jì)算結(jié)果：采用Image J軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，Western Blot結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示。組間比較采用獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U檢驗(yàn)）方法。采用相關(guān)樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（Wilcoxon帶符號(hào)秩檢驗(yàn)）分析高溫運(yùn)動(dòng)各組大鼠運(yùn)動(dòng)前后直腸溫度。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有非常顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的體重與運(yùn)動(dòng)時(shí)間

高溫運(yùn)動(dòng)前，6組大鼠體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖2a）；進(jìn)行高溫運(yùn)動(dòng)的5組大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖2b）。

圖2 各組大鼠的體重與運(yùn)動(dòng)時(shí)間Figure2 Body Weight and Exercise Duration of Rats in Each Group

2.2 各組大鼠的體溫及冷卻速率

與NC組相比，經(jīng)過(guò)適應(yīng)訓(xùn)練的HE組大鼠在高溫運(yùn)動(dòng)前體溫顯著升高（P＜0.05）；但是HE組大鼠與其他4組經(jīng)過(guò)適應(yīng)訓(xùn)練的大鼠（HER1，HEC1，HER2，HEC2）在高溫運(yùn)動(dòng)前體溫進(jìn)行兩兩比較并無(wú)顯著性差異。與運(yùn)動(dòng)前體溫自身對(duì)照，HE組與HEC2組大鼠體溫在高溫運(yùn)動(dòng)后顯著升高（P＜0.05）；HER1組與HER2組大鼠體溫在高溫運(yùn)動(dòng)后非常顯著升高（P＜0.01）；HEC1組大鼠運(yùn)動(dòng)后體溫?zé)o顯著性差異（P＞0.05），這是因?yàn)檫@組大鼠中有一只大鼠運(yùn)動(dòng)后體溫出現(xiàn)了異常值（39.85℃），沒(méi)有足夠的理由剔除它，但是如果去掉這個(gè)異常值，運(yùn)動(dòng)后體溫跟運(yùn)動(dòng)前體溫有顯著差異（P＜0.05）。高溫運(yùn)動(dòng)大鼠各組間體溫上升無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與HER1組相比，HEC1組大鼠體溫在運(yùn)動(dòng)前、運(yùn)動(dòng)后及上升值方面均無(wú)顯著性差異，但是冷浸5 min后的體溫非常顯著降低（P＜0.01）；與HER2組相比，HEC2組大鼠體溫在運(yùn)動(dòng)前、運(yùn)動(dòng)后及上升值方面均無(wú)顯著性差異，但是冷浸5 min后的體溫非常顯著降低（P＜0.01）。在20℃環(huán)境中休息60 min期間，HER2組和HEC2組大鼠體溫均持續(xù)下降，二者分別在休息30 min和休息20 min時(shí)降到最低值，隨后體溫均開(kāi)始回升；每間隔10 min的HEC2組大鼠體溫均顯著低于HER2組大鼠體溫（P＜0.05）。參加冷浸的HEC1組和HEC2組大鼠冷卻速率分別為（1.15±0.24）℃/min和（1.10±0.26）℃/min，二者無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（見(jiàn)表3）。

表3 各組大鼠的體溫及冷卻速率Table3 Core Body Temperature and Cooling Rate of Rats in Each Group

2.3 各組大鼠的紅細(xì)胞壓積與血紅蛋白

與NC組相比，HE組大鼠紅細(xì)胞壓積顯著升高（P＜0.05）；與HE組相比，HER1組、HEC1組、，HER2組、HEC2組大鼠紅細(xì)胞壓積無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與HER1組相比，HEC1組大鼠紅細(xì)胞壓積無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與HER2組相比，HEC2組大鼠紅細(xì)胞壓積無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖3a）。與NC組相比，HE組大鼠血紅蛋白無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與HE組相比，HER1組、HEC1組、HER2組、HEC2組大鼠血紅蛋白無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與HER1組相比，HEC1組大鼠血紅蛋白無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與HER2組相比，HEC2組大鼠血紅蛋白無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖3b）。

圖3 各組大鼠的紅細(xì)胞壓積與血紅蛋白Figure3 Hematocrit and Hemoglobin of Rats in Each Group

2.4 各組大鼠的血液抗利尿激素

與NC組相比，HE組大鼠血液抗利尿激素非常顯著升高（P＜0.01）；與HE組相比，HER1組、HEC1組、HER2組、HEC2組大鼠血液抗利尿激素?zé)o顯著性差異（P＞0.05）；與HER1組相比，HEC1組大鼠血液抗利尿激素?zé)o顯著性差異（P＞0.05）；與HER2組相比，HEC2組大鼠血液抗利尿激素?zé)o顯著性差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖4）。

圖4 各組大鼠的抗利尿激素Figure4 Arginine Vasopressin of Rats in Each Group

2.5 各組大鼠下丘腦AVPmRNA表達(dá)

與NC組相比，HE組大鼠下丘腦AVPmRNA表達(dá)非常顯著上調(diào)（P＜0.01）；與HE組相比，常溫休息HER1組和HER2組大鼠下丘腦AVPmRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），經(jīng)過(guò)冷浸的HEC1組和HEC2組大鼠下丘腦AVPmRNA表達(dá)非常顯著下調(diào)（P＜0.01）；與休息HER1組相比，冷浸HEC1組大鼠下丘腦AVPmRNA表達(dá)非常顯著下調(diào)（P＜0.01）；與HER2組相比，HEC2組大鼠下丘腦AVPmRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖5）。

圖5RNA電泳和qRT-PCR結(jié)果Figure5 RNA Electrophorogram and qRT-PCR Results

2.6 各組大鼠下丘腦AVP蛋白表達(dá)

與NC組相比，HE組大鼠下丘腦AVP蛋白表達(dá)非常顯著性上調(diào)（P＜0.01）；與HE組相比，常溫休息HER1組和HER2組大鼠下丘腦AVP蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），經(jīng)過(guò)冷浸的HEC1組和HEC2組大鼠下丘腦AVP蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05）；與HER1組相比，HEC1組大鼠下丘腦AVP蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與HER2組相比，HEC2組大鼠下丘腦AVP蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖6）。

圖6 Western Blot結(jié)果Figure6 The Results of Western Blot

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動(dòng)及冷療對(duì)大鼠體溫的影響

ZHANG[15]建立了勞力性熱射病大鼠模型，用于研究紅景天苷對(duì)線粒體的保護(hù)作用，大鼠在建模前并未進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。為了研究肝素對(duì)勞力性熱射病大鼠模型早期干預(yù)的作用，陳潔坤[16]建立了勞力性熱射病大鼠模型，所有大鼠先經(jīng)過(guò)6天適應(yīng)性訓(xùn)練后再進(jìn)行分組，適應(yīng)性訓(xùn)練是否會(huì)引起大鼠體溫變化未見(jiàn)報(bào)道。與前人的研究有所不同，本研究中的常溫對(duì)照組（NC）未經(jīng)過(guò)適應(yīng)性訓(xùn)練，而5個(gè)高溫運(yùn)動(dòng)組（HE，HER1，HEC1，HER2，HEC2）大鼠均參加了適應(yīng)性訓(xùn)練。高溫運(yùn)動(dòng)前，HE組大鼠體溫顯著高于NC組大鼠體溫，但是與其他4組大鼠體溫相互之間并無(wú)顯著性差異，提示適應(yīng)性訓(xùn)練也會(huì)引起大鼠體溫上升。

實(shí)驗(yàn)室熱射病動(dòng)物模型包括狒狒模型，大鼠模型，小鼠模型等。鑒于非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物（如狒狒）體溫調(diào)節(jié)反應(yīng)比任何其他物種更能匹配人類的體溫調(diào)節(jié)反應(yīng)，BOUCHAMA[9]在44～47℃的熱應(yīng)激中建立了經(jīng)典型熱射病狒狒模型并進(jìn)行了炎癥、止血及臨床變化的研究，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)典型熱射病狒狒模型中，動(dòng)脈收縮壓下降到90 mmHg以下即體溫上升到（43.3±0.1）℃的重度熱射病狒狒在145～265 min內(nèi)全部死亡；體溫上升到（42.5±0.0）℃的中度熱射病狒狒全部存活，但均表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)障礙。LAM[10]建立了經(jīng)典型熱射病大鼠模型，用于研究3-（5′-羥甲基-2′-呋喃基）-1-芐基吲唑（YC-1）在治療熱射病大鼠中熱休克蛋白HSP70所起到的保護(hù)性作用，發(fā)現(xiàn)在42℃熱應(yīng)激中建立的體溫在42.0℃左右的熱射病大鼠模型的體溫顯著高于對(duì)照組。為了研究多器官損傷的生物標(biāo)志，KING[17]在37.5、38.5、和39.5℃3種熱環(huán)境中通過(guò)轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)建立了勞力性熱射病小鼠模型，建模標(biāo)準(zhǔn)為小鼠熱運(yùn)動(dòng)至出現(xiàn)限制性神經(jīng)癥狀（意識(shí)喪失），研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)限制性神經(jīng)癥狀（意識(shí)喪失）時(shí)所能達(dá)到的最高核心溫度為42.1～42.5℃。CHANG[11]的研究發(fā)現(xiàn)在36℃環(huán)境下熱運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)，大鼠出現(xiàn)勞力性熱射病癥狀包括體溫過(guò)高、嚴(yán)重低血壓、神經(jīng)功能障礙和腦損傷。與BOUCHAMA建立的中度熱射病狒狒模型標(biāo)準(zhǔn)有所不同，本研究中高溫運(yùn)動(dòng)至力竭的5組大鼠運(yùn)動(dòng)后體溫并未上升到42.5℃；但是由于其運(yùn)動(dòng)后體溫均上升到42.0℃左右，且與運(yùn)動(dòng)前體溫相比均有顯著性差異，這與LAM（2013）及CHANG（2017）的熱射病大鼠模型相一致，說(shuō)明這5組大鼠符合勞力性熱射病大鼠建模標(biāo)準(zhǔn)。與KING（2015）熱射病小鼠模型相類似，大鼠熱運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)出現(xiàn)了意識(shí)喪失，且意識(shí)喪失時(shí)所能達(dá)到的最高核心溫度為42.11～42.43℃，進(jìn)一步證明本研究勞力性熱射病大鼠建模成功。

MCDERMOTT等[12]的研究認(rèn)為快速降溫是熱射病救治的關(guān)鍵，在諸多降溫措施中，冷水浸泡的冷卻速率最快，其中2℃冷水浸泡的冷卻速率是0.35℃/min，8℃和20℃冷水浸泡的冷卻速率均為0.19℃/min；另外一些替代性冷卻策略，如冷卻水霧噴灑、靜脈冷卻注射、冰覆外周動(dòng)脈、洗胃、降溫毯等由于冷卻速率過(guò)低而不建議用于熱射病快速冷卻的救治。低溫環(huán)境有助于冷卻病人。O'CONNOR[18]的研究發(fā)現(xiàn)-18℃和0℃的輻射冷卻速率分別為0.06℃/min和0.04℃/min，均優(yōu)于全身敷冰0.03℃/min的冷卻速率，提出輻射冷卻可以輔助其他冷卻方法，用于患者冷卻救治。WOHLFERT[19]的研究表明，在勞力性熱射病冷卻急救中，進(jìn)行全身冷水浸泡（Cold water immersion，CWI）是降低患者核心溫度最有效的方法，可以使熱射病患者的存活率提升到接近100%。STEWART[13]等的研究認(rèn)為：大部分勞力性熱射病患者具有41.0～43.5℃之間的核心體溫，而冷卻終止點(diǎn)時(shí)的核心體溫為38.9℃，針對(duì)每5 min降低1℃的冷卻速率，提出可以用冷水浸泡15 min，或者提供合理的冷卻終止點(diǎn)進(jìn)行冷卻治療。GODEK等[20]的研究發(fā)現(xiàn)：10℃冷水浸泡時(shí)，越野賽運(yùn)動(dòng)員的冷卻速率為0.255℃/min，核心溫度從39.5℃降到37.5℃僅需要7.7 min。依據(jù)WOHLFERT的最新研究，本研究采用冷水浸泡作為勞力性熱射病大鼠的冷卻治療方法。本研究中，HEC1組大鼠19℃冷浸5 min后體溫降到低于運(yùn)動(dòng)前體溫，且顯著低于HER1組大鼠體溫；HEC2組大鼠19℃冷浸5 min體溫及休息60 min體溫均降到低于運(yùn)動(dòng)前體溫，且顯著低于HER2組大鼠休息5 min體溫及休息60 min體溫，說(shuō)明19℃冷浸5 min可以有效降低勞力性熱射病大鼠體溫并能維持至少60 min時(shí)間。與MCDERMOTT，STEWART，GODEK等的研究有所不同，本研究中2組大鼠19℃冷水浸泡時(shí)冷卻速率分別為1.15和1.10℃/min，冷浸時(shí)間僅為5 min，比人體冷浸時(shí)降溫速率更快，冷浸時(shí)間更短，提示物種間的差異可能會(huì)產(chǎn)生不同的熱調(diào)節(jié)反應(yīng)，來(lái)自動(dòng)物冷卻實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，應(yīng)用于馬拉松等耐力性運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目勞力性熱射病發(fā)作后的冷卻急救時(shí)冷浸水溫及冷浸時(shí)間要作適當(dāng)調(diào)整。在20℃環(huán)境中休息60 min期間，HER2組和HEC2組大鼠體溫均先下降再回升；且HEC2組大鼠體溫顯著低于HER2組大鼠同一時(shí)間點(diǎn)體溫，說(shuō)明20℃環(huán)境休息不僅有助于降溫，也有助于維持冷卻治療效果，這與O'CONNOR低溫輻射冷卻可以輔助其它冷卻方法用于患者冷卻救治的研究類似，提示可以采用20℃環(huán)境休息輔助冷水浸泡的方法應(yīng)用于馬拉松等耐力性運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目中勞力性熱射病患者的冷卻救治。

3.2 運(yùn)動(dòng)及冷療對(duì)大鼠血液濃縮程度的影響

紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白是血常規(guī)檢查中反映血液濃縮程度的重要指標(biāo)。劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)大量出汗會(huì)使機(jī)體脫水，血液濃縮，紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白會(huì)相對(duì)升高。測(cè)定紅細(xì)胞壓積及血紅蛋白有助于了解血液濃縮程度，因而可作為熱射病實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)。全軍重癥醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)在熱射病規(guī)范化診斷與治療專家共識(shí)（草案）中，提出勞力性熱射病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)包括血常規(guī)檢測(cè)：熱射病發(fā)病早期因脫水致血液濃縮可出現(xiàn)血紅蛋白（Hb）升高、紅細(xì)胞壓積（Hct）增加、血小板（PLT）發(fā)病初期正常，繼而迅速下降等癥狀[21]。本研究中，HE組大鼠紅細(xì)胞壓積顯著高于NC組大鼠紅細(xì)胞壓積；證明大鼠進(jìn)行高溫運(yùn)動(dòng)確實(shí)會(huì)因?yàn)槊撍饳C(jī)體血液濃縮，這與前人的研究結(jié)果相一致。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與NC組大鼠相比，HE組大鼠血紅蛋白濃度雖然升高，但并未引起顯著性差異，提示在反應(yīng)血液濃縮程度方面，血紅蛋白不夠敏感。本研究中，HE組大鼠在高溫力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)勞力性熱射病發(fā)作時(shí)出現(xiàn)紅細(xì)胞壓積顯著性升高，說(shuō)明機(jī)體嚴(yán)重脫水，提示紅細(xì)胞壓積是高溫力竭運(yùn)動(dòng)中勞力性熱射病病理生理學(xué)改變的敏感指標(biāo)，可作為馬拉松等耐力性運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目勞力性熱射病研究的病理生理學(xué)指標(biāo)。

RIANA[4]在海軍陸戰(zhàn)隊(duì)馬拉松運(yùn)動(dòng)中勞力性熱射病處理流程中提出：冷水浸泡是熱射病患者救治的首選方案；冷卻啟動(dòng)后，應(yīng)獲得患者的血液化學(xué)樣品，即時(shí)檢測(cè)鈉Na，葡萄糖Gluc，鉀K，肌酐Cr、血尿素氮BUN，氯Cl和紅細(xì)胞壓積Hct等；治療脫水、低血糖和低鈉血癥。關(guān)于冷卻對(duì)血液濃縮程度影響的研究鮮為報(bào)道。LIPINA[22]在研究大鼠血液粘度的溫度依賴性時(shí)，發(fā)現(xiàn)冷卻會(huì)使大鼠血液濃縮，紅細(xì)胞壓積升高。與LIPINA的研究不同，本研究中大鼠在冷浸后即刻及其后60 min時(shí)紅細(xì)胞壓積及血紅蛋白雖然有下降及恢復(fù)正常的趨勢(shì)，但并未出現(xiàn)顯著性變化，說(shuō)明冷浸對(duì)高溫力竭運(yùn)動(dòng)造成的血液濃縮影響不明顯，提示冷浸并未明顯改善機(jī)體的脫水狀況。

3.3 勞力性熱射病大鼠冷卻治療中抗利尿激素調(diào)節(jié)機(jī)制探討

CASA等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)時(shí)水分丟失是引起體溫升高的重要因素?？估蚣に兀ㄒ喾Q精氨酸加壓素）是機(jī)體調(diào)節(jié)水平衡的重要激素，它是由下丘腦視上核和視旁核的神經(jīng)元細(xì)胞體合成并分泌的9肽激素，通過(guò)神經(jīng)垂體后葉釋放入血液，主要作用是調(diào)節(jié)腎臟對(duì)水的重吸收，引起尿液濃縮，起到抗利尿效果。除了通過(guò)抗利尿（抗脫水）途徑維護(hù)體溫調(diào)節(jié)的作用外，抗利尿激素還是重要的內(nèi)源性體溫調(diào)節(jié)因子，AVP及其V1a受體拮抗劑能夠分別誘導(dǎo)低體溫和高體溫。在研究大鼠視前-下丘腦對(duì)溫度敏感神經(jīng)元和對(duì)溫度不敏感神經(jīng)元對(duì)體溫調(diào)節(jié)的精確反應(yīng)時(shí)，TANG等[24]通過(guò)監(jiān)測(cè)神經(jīng)元的放電活動(dòng)和熱敏感性變化發(fā)現(xiàn)，AVP增加了65%溫敏神經(jīng)元的自發(fā)放電率，并幾乎降低了50%冷敏神經(jīng)元和對(duì)溫度不敏感神經(jīng)元的自發(fā)放電率，由于興奮溫敏神經(jīng)元或抑制冷敏和不敏感神經(jīng)元會(huì)促進(jìn)熱量損失或抑制熱量生產(chǎn)和保存，因而提出AVP興奮溫敏神經(jīng)元以及抑制冷敏神經(jīng)元和不敏感神經(jīng)元是AVP誘導(dǎo)體溫過(guò)低的可能機(jī)制。

熱射病實(shí)驗(yàn)室檢查中，有關(guān)抗利尿激素的研究并不常見(jiàn)。在利用肝移植治療勞力性熱射病后肝衰竭患者的研究中，SAISSY等[25]證明，勞力性熱射病會(huì)引起急性肝衰竭，這不僅與高熱會(huì)直接損傷肝實(shí)質(zhì)有關(guān)，也與抗利尿激素分泌過(guò)多使血液再分配引起的急性肝缺血病情加重有關(guān)。在研究倫敦馬拉松運(yùn)動(dòng)相關(guān)低鈉血癥的發(fā)生率時(shí)，KIPPS[26]證實(shí)，運(yùn)動(dòng)性低鈉血癥是耐力運(yùn)動(dòng)中一種潛在的致死原因，它與運(yùn)動(dòng)過(guò)程中抗利尿激素過(guò)度釋放有關(guān)。本研究中，相比于NC組大鼠，HE組大鼠在高溫力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)勞力性熱射病發(fā)作時(shí)出現(xiàn)下丘腦抗利尿激素AVPmRNA表達(dá)、下丘腦抗利尿激素AVP蛋白表達(dá)、血液抗利尿激素均非常顯著性上調(diào)，提示勞力性熱射病與運(yùn)動(dòng)過(guò)程中抗利尿激素過(guò)度合成與釋放有關(guān)，這與SAISSY及KIPPS的抗利尿激素與疾病關(guān)系研究相類似，說(shuō)明勞力性熱射病發(fā)作時(shí)機(jī)體出現(xiàn)過(guò)度抗利尿反應(yīng)，以此對(duì)抗高溫力竭運(yùn)動(dòng)引起的高體溫及嚴(yán)重脫水情況。此結(jié)果進(jìn)一步提示抗利尿激素、抗利尿激素AVPmRNA表達(dá)及抗利尿激素AVP蛋白表達(dá)是高溫力竭運(yùn)動(dòng)中勞力性熱射病病理生理學(xué)改變的敏感指標(biāo)，可作為馬拉松等耐力性運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目勞力性熱射病研究的病理生理學(xué)標(biāo)志物。

JASNIC等[27]的研究表明，除了熱暴露，冷暴露也能誘導(dǎo)下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的激活和抗利尿激素（AVP）的釋放，二者均能引起下丘腦AVP蛋白表達(dá)的顯著性升高；且38℃熱應(yīng)激引起的AVP升高比4℃冷應(yīng)激引起的AVP升高更顯著。與JASNIC的研究不同，本研究中，在冷浸后即刻及其后60 min時(shí)，AVPmRNA表達(dá)均非常顯著性下調(diào)、AVP蛋白表達(dá)均顯著性下調(diào)；而血液AVP均未出現(xiàn)顯著性變化。這種現(xiàn)象說(shuō)明冷浸對(duì)下丘腦AVPmRNA表達(dá)的影響最顯著，對(duì)下丘腦AVP蛋白表達(dá)的影響次之，而對(duì)血液AVP的影響甚微；進(jìn)一步證明冷浸對(duì)抗利尿激素的影響符合從下丘腦AVPmRNA表達(dá)到下丘腦AVP蛋白表達(dá)，再到AVP釋放入血液的逐級(jí)滯后的合成與釋放順序。這種現(xiàn)象也說(shuō)明冷浸后60 min的20℃環(huán)境休息延續(xù)了冷浸對(duì)AVP的影響，有助于維持冷卻治療效果。AVPmRNA表達(dá)及AVP蛋白表達(dá)反映的是AVP在下丘腦的合成情況。冷浸治療后，AVPmRNA表達(dá)非常顯著性下調(diào)、AVP蛋白表達(dá)顯著性下調(diào)，說(shuō)明冷浸治療降低了抗利尿激素在下丘腦的合成，其機(jī)制可能是機(jī)體降溫后病情開(kāi)始轉(zhuǎn)歸，依賴AVP抗脫水及誘導(dǎo)低體溫的作用減弱，機(jī)體試圖通過(guò)減少AVP的合成來(lái)減弱過(guò)度抗利尿反應(yīng)重建自身體溫調(diào)節(jié)。血清AVP反映的是AVP合成后釋放入血的情況。冷浸后血清AVP雖然比熱射病發(fā)作時(shí)有所下降，但并沒(méi)有出現(xiàn)顯著性差異；在其后60 min的20℃環(huán)境休息中，AVP雖然有所上升，但也沒(méi)有出現(xiàn)顯著性差異，說(shuō)明冷浸治療對(duì)抗利尿激素的釋放沒(méi)有明顯影響，冷浸不會(huì)引起尿量增多及加重脫水的情況，其機(jī)制與AVP釋放入血的過(guò)程滯后于下丘腦AVP的合成有關(guān)。研究結(jié)果提示，下丘腦AVPmRNA表達(dá)及AVP蛋白表達(dá)是勞力性熱射病冷卻急救中病情轉(zhuǎn)歸的敏感指標(biāo)，可作為馬拉松等耐力性運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目勞力性熱射病冷卻急救研究的病理生理學(xué)標(biāo)志物；而血清AVP不是勞力性熱射病冷卻急救中病情轉(zhuǎn)歸的敏感指標(biāo)。

4 結(jié) 論

冷浸可以快速降低熱射病大鼠機(jī)體核心溫度；使AVPm-RNA表達(dá)及AVP蛋白表達(dá)顯著性下調(diào)，改善抗利尿激素在下丘腦的合成；但是冷浸對(duì)血清AVP和Hct沒(méi)有顯著性影響，不能明顯改善抗利尿激素在下丘腦的釋放以及改善機(jī)體脫水狀況。