布日額，陳金龍， 葉 俊，吳金花，錫林高娃，王金良

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)乳源性致病菌防控工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古通遼028043；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼028043；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028043；5.內(nèi)蒙古民族大學(xué)乳源性致病菌研究所,內(nèi)蒙古通遼028043；6.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600)

牛結(jié)核分枝桿菌病(Bovine tuberculosis，TB)是由牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis，MB)引起的一種以進(jìn)行性消瘦、咳嗽、呼吸困難等為主要癥狀的人畜共患慢性傳染病。MB為細(xì)胞內(nèi)寄生菌，對(duì)人畜危害大，被OIE列為B類動(dòng)物傳染病[1-3]。近年來(lái)，在我國(guó)隨著以牛奶為主的乳制品的需求量的不斷增加，奶牛養(yǎng)殖業(yè)得到迅速發(fā)展，同時(shí)結(jié)核菌素(PPD)皮試陽(yáng)性牛的檢出率也顯示逐年上升的趨勢(shì)，由TB引起的直接或者間接損失和危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)牛的其它任何一種疾病[4]。由于TB的潛伏期長(zhǎng)，而目前的檢測(cè)方法檢出的陽(yáng)性?；旧鲜蔷哂忻黠@結(jié)核癥狀的牛，其體內(nèi)受侵害的器官、組織中的MB已經(jīng)大量增殖，診斷陽(yáng)性病畜乳、肉等產(chǎn)品中MB的數(shù)量已經(jīng)達(dá)到人畜感染劑量，并開(kāi)始向外界排泄致病菌。因此，在MB感染早期能夠快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，對(duì)于保障牛乳肉等產(chǎn)品的公共衛(wèi)生安全具有重要意義。另外，對(duì)TB陽(yáng)性牛的處置方法是淘汰捕殺，MB的凈化是控制和消滅人類結(jié)核病的重要環(huán)節(jié)[5]。迄今為止，我國(guó)主要通過(guò)PPD介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)來(lái)判定牛是否感染MB，此種方法耗時(shí)長(zhǎng)，而且存在較大的免疫交叉反應(yīng)，因此TB的凈化也迫切需要一種快速、精準(zhǔn)的新型感染早期檢測(cè)方法[6-7]。

MB在增殖過(guò)程中分泌多種蛋白[8]，MPB70、MPB83是MB兩種同源分泌蛋白，屬于MB感染潛伏期早期標(biāo)識(shí)性分泌性蛋白，MPB70蛋白具有高度可溶性，已有相關(guān)研究表明此種蛋白可以作為診斷TB的抗原，MPB83是MB菌體表面一種特異性的糖脂蛋白抗原，也可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[9]。本研究將TB的MPB70與MPB83主要抗原區(qū)域基因片段進(jìn)行融合表達(dá)及抗原性鑒定，為進(jìn)一步研究TB感染早期快速檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)品提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 MB總DNA為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所贈(zèng)送；pMD18-T克隆載體、DH5α和BL21即用型感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；pGEX-6p-1原核表達(dá)載體由內(nèi)蒙古自治區(qū)乳源性致病菌防控工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存。

10×PCR Buffer、dNTP、高保真 DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、T4 DNA Ligase、BamHⅠ、XhoⅠ均購(gòu)自NEB公司；氨芐青霉素及IPTG均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒、GST標(biāo)簽蛋白親和層析填料、DAB、TMB底物溶液均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 MPB70、MPB83基因主要抗原域確定 采用DNAStar Protean對(duì) MPB70(EU683971.1)和 MPB83(EU683972.1)基因進(jìn)行抗原決定簇的表位分析，篩選主要抗原域，并在MPB70和MPB83間引入16位柔性氨基酸殘基序列GGGSGGGSGGGSG GGS。

1.3 重疊延伸PCR(SOE-PCR)技術(shù)融合MPB70及MPB83基因 根據(jù)1.2分析結(jié)果，參照MPB70(EU683971.1)和MPB83(EU683972.1)基因序列，設(shè)計(jì)4條引物(表1)，采用SOE-PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪PCR：以MB總DNA為模板，以MPB70F/MPB70R為擴(kuò)增引物，擴(kuò)增MPB70基因片段(426 bp)；以MB總DNA為模板，以MPB83F/MPB83R為引物，擴(kuò)增MPB83基因片段(513 bp)；反應(yīng)條件為：94℃3 min；94℃45 s、56℃45 s、72℃ 45 s，5個(gè)循環(huán)；72℃5 min，4℃終止。第二輪PCR：以擴(kuò)增的MPB70、MPB83為模板，以 MPB70F/MPB83R為引物，擴(kuò)增產(chǎn)物即為MPB70+MPB83串聯(lián)基因，預(yù)期片段987 bp；反應(yīng)條件為：94℃4 min；94℃60 s、62℃45 s、72℃60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并測(cè)序。

表1 SOE-PCR引物序列

1.4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 回收MPB70+MPB83串聯(lián)基因片段。利用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切膠回收后與pGEX-6p-1原核表達(dá)載體連接，經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化篩選后最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定的陽(yáng)性克隆由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序分析，命名為pGEX-MPB70-MPB83。

1.5 重組基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將重組質(zhì)粒pGEX-MPB70-MPB83轉(zhuǎn)化至BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，37℃振搖培養(yǎng)至OD600nm為0.8時(shí)加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析、親和層析純化及蛋白濃度測(cè)定。以GST標(biāo)簽鼠源單克隆抗體(1∶1 000)為一抗，羊抗鼠IgG-HPR(1∶5 000)為二抗，利用western blot分析融合蛋白的表達(dá)情況。

1.6 MPB70+MPB83融合蛋白免疫小鼠試驗(yàn) 首免采用純化的MPB70+MPB83蛋白50 μg與等體積的弗氏完全佐劑乳化后以50 μg/只皮下注射，然后每間隔14 d以同樣方式進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫2次，第2次加強(qiáng)免疫后第14 d(即首次免疫后35 d)采血制備血清，將免疫小鼠待檢血清(1∶1 000)作為一抗，以羊抗鼠IgG-HPR(1∶5 000)為二抗，利用間接ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)，當(dāng)免疫血清效價(jià)達(dá)到1∶10 000時(shí)，用100 μg純化融合蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3 d后采血制備血清，采用上述ELISA方法檢測(cè)小鼠抗體效價(jià)，以評(píng)價(jià)MPB70+MPB83融合蛋白的免疫原性。

2 結(jié)果

2.1 MPB70、MPB83主要抗原域確定 對(duì)MPB70(EU683971.1)和MPB83(EU683972.1)基因分析并篩選出得分最高的主要抗原域，選取了MPB70基因的aa30～aa171，MPB83基因的aa20～aa190為主要抗原基因擴(kuò)增區(qū)域(圖1、圖2)。在 MPB70、MPB83間加入16位柔性多肽序列，經(jīng)在線分析軟件分析其對(duì)MPB70和MPB83融合后抗原性無(wú)影響。

2.2 MPB70、MPB83基因擴(kuò)增及SOE-PCR擴(kuò)增結(jié)果 第一輪PCR擴(kuò)增分別得到約400 bp和500 bp的片段，第二輪PCR擴(kuò)增得到約1 000 bp的MPB70F和MPB83R串聯(lián)基因片段，均與預(yù)期大小結(jié)果相符(圖3)。經(jīng)測(cè)序，結(jié)果顯示融合基因序列正確，表明獲得MPB70和MPB83主要抗原域基因的融合基因。

2.3 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 回收MPB70+MPB83融合基因片段，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-MPB70-MPB83，鑒定結(jié)果顯示重組質(zhì)粒雙酶切可見(jiàn)約1 000 bp和5 000 bp兩條帶(圖4)；進(jìn)一步對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果顯示MPB70+MPB83融合基因無(wú)堿基突變和缺失。以上結(jié)果表明pGEXMPB70-MPB83重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。

2.4 重組基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化 將重組pGEX-MPB70-MPB83質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，在約58 ku處出現(xiàn)目的條帶，western blot鑒定結(jié)果與其一致，大小與預(yù)期相符(圖5)，表明目的基因獲得有效表達(dá)；可溶性鑒定顯示，目的蛋白上清和沉淀中均有表達(dá)產(chǎn)物存在，破碎后菌體上清經(jīng)親和層析純化后蛋白濃度為1.2 mg/mL。

2.5 MPB70+MPB83融合蛋白小鼠免疫結(jié)果 實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)4次免疫后，ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示(圖6)，首免7 d血清抗體開(kāi)始轉(zhuǎn)陽(yáng)，抗體效價(jià) 35 d 時(shí)達(dá)到 1∶12 800，45 d 時(shí)達(dá)到 1∶51 200(圖7)，免疫前抗體為陰性，表明MPB70+MPB83融合蛋白免疫能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生高效價(jià)抗體，具有良好的免疫原性。

3 討論

我國(guó)北方幾個(gè)省區(qū)是TB發(fā)生相對(duì)比較嚴(yán)重的地區(qū)，據(jù)報(bào)道北方某地區(qū)的奶牛場(chǎng)奶牛TB的個(gè)體陽(yáng)性率達(dá)到13.99%，群陽(yáng)性率達(dá)到55.51%，而且農(nóng)區(qū)的奶牛陽(yáng)性率(23.80%)高于郊區(qū)奶牛的陽(yáng)性率(13.32%)，泌乳奶牛的TB陽(yáng)性率平均達(dá)到17.96%[10]，上述數(shù)據(jù)表明，我國(guó)北方乳源由TB導(dǎo)致的嚴(yán)重隱患已達(dá)到不容忽視的程度。MB感染機(jī)體后潛伏期長(zhǎng)短不一，通常為15 d以上至數(shù)月，該致病菌在侵入機(jī)體處于潛伏期時(shí)分泌ESAT-6系列、Hsp65、Ag85、MPB70、MPB83等分泌性蛋白，導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生一系列的細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者對(duì)這些抗原基因做過(guò)相關(guān)研，Tashakkori等人于2016年擴(kuò)增了MB 687 bp的mpt64基因，并獲得了表達(dá)，表達(dá)的蛋白大小為24 ku，western blot證明其具有良好的抗原反應(yīng)性[11]。平曉坤等于2018年擴(kuò)增了MB的ptpA基因，并誘導(dǎo)表達(dá)及純化了ptpA蛋白，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)[12]；王曉龍等于2016年擴(kuò)增了鹿結(jié)核分枝桿菌MPB70基因并在pET30a表達(dá)載體中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物與鹿結(jié)核桿菌有特異性的免疫反應(yīng)[13]。2016年陳爽將MB的ESAT6、CFP10、MPB83和FixB基因分別進(jìn)行了克隆表達(dá)并將表達(dá)抗原混合后建立了TB的間接ELISA檢測(cè)方法[14]。上述研究結(jié)果表明，利用MB的分泌性蛋白做為感染早期處于潛伏狀態(tài)牛的早期檢測(cè)標(biāo)識(shí)物具有可行性。

本研究在利用DNAstar7.0軟件綜合分析MB早期標(biāo)識(shí)性分泌性蛋白MPB70、MPB83抗原基礎(chǔ)上，篩選確定了MPB70與MPB83蛋白編碼基因主要抗原域，利用SOE-PCR技術(shù)，構(gòu)建了MPB70、MPB83串聯(lián)重組體。通過(guò)在MPB70和MPB83多肽間引入16位柔性氨基酸殘基(GGGSGGGSGGGSG GGS)的柔性多肽，以確保MPB70和MPB83獨(dú)立的天然抗原結(jié)構(gòu)[15-16]，Protean軟件分析和表達(dá)蛋白western blot鑒定均表明，引入的柔性多肽對(duì)融合蛋白的表達(dá)及對(duì)其抗原性無(wú)影響。融合蛋白的可溶性分析表明，表達(dá)的MPB70+MPB83融合蛋白以可溶性及包涵體的形式存在。小鼠的免疫試驗(yàn)也表明，MPB70+MPB83融合蛋白免疫能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)到1∶51 200，因此，MPB70+MPB83融合蛋白具有良好免疫原性。本研究為進(jìn)一步研制基于早期標(biāo)識(shí)性分泌蛋白MPB70+MPB83融合抗原免疫制劑和快速檢測(cè)試劑奠定了基礎(chǔ)。