盧建軍，楊 帆*，楊 婧，陳良強，劉延峰，王和玉，王 莉

（1.貴州茅臺酒股份有限公司 技術中心，貴州 仁懷 564500；

2.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

白酒中關鍵風味物質的微生物溯源是白酒研究的一項重要工作，其研究成果的應用對白酒產(chǎn)量和品質的保障和提升具有明顯的作用[1-4]。但白酒釀造過程是開放的多菌種混合固態(tài)發(fā)酵體系，其復雜的微生物結構和風味組成使得對產(chǎn)目標風味物質微生物的溯源十分困難。目前主要是通過可培養(yǎng)手段大量獲得微生物資源并逐個進行功能驗證開展溯源研究[5-8]，但該過程存在工作量大，目標性差，篩選結果不可預知等不足。

隨著生物技術的發(fā)展，針對微生物的研究手段已經(jīng)從細胞水平轉向了分子水平的研究[9]。在此過程中關于核酸、蛋白質等生物信息數(shù)據(jù)大量積累，形成了包含有眾多生物資源信息的數(shù)據(jù)庫，依據(jù)資源信息類別與研究用途不同，生物信息學數(shù)據(jù)庫可分為15個大類[10]。目前數(shù)據(jù)庫中的生物信息資源已被廣泛應用于微生物研究領域，為微生物鑒定、基因水平溯源、化合物合成及致病基因研究提供了有力支持[11-12]。迄今為止，利用生物信息數(shù)據(jù)資源指導風味物質的微生物溯源尚鮮見報道。

高級醇是我國傳統(tǒng)白酒的芳香組分之一，能夠襯托酒體酯類香氣，但含量過高又會引起酒體辛辣，使人上頭易醉[13]。正丙醇作為高級醇的重要組成部分，其含量已成為我國酒精類食品檢測的一項重要指標[14]。目前關于白酒中產(chǎn)正丙醇微生物研究主要集中在酵母菌[15-17]與芽孢桿菌[14，18]，而白酒中其他微生物代謝產(chǎn)正丙醇的相關研究報道較少。該研究擬利用生物信息數(shù)據(jù)資源對白酒中產(chǎn)正丙醇微生物進行溯源，并對菌株進行發(fā)酵實驗驗證其產(chǎn)正丙醇能力。通過篩選白酒釀造中高產(chǎn)正丙醇的優(yōu)勢微生物，明確釀造過程中產(chǎn)正丙醇的微生物種類及組成，為白酒中正丙醇的調(diào)控奠定研究基礎，為后期工藝控制提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

布赫內(nèi)氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、面包乳桿菌（Lactobacillus panis）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、橋乳桿菌（Lactobacillus pontis）、耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentose）：茅臺微生物菌種庫保存。

正丙醇（色譜純）、叔戊醇（色譜純）：美國Sigma公司；氯化鈉（分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

KS4000i搖床：德國艾卡公司；380R離心機：德國Hettich公司；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱：上海飛越實驗儀器有限公司；JAR GASSING SYSTEM厭氧培養(yǎng)罐：英國DWS公司；IEC61010-1超凈工作臺：新加坡藝思高科技有限公司；CL-32L全自動蒸汽滅菌器：日本ALP株式會社；G1888A-7890A-5975C頂空-氣相色譜-質譜（headspace-gas chromatographymass spectrometry，HS-GC-MS）聯(lián)用儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 代謝通路與關鍵酶查詢

利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對目標物質進行比對，明確其代謝通路及參與反應的酶，確定目標物質代謝所需關鍵催化酶。具體步驟：（1）利用KEGG COMPOUND DATABASE（代謝物及其他小分子化合物數(shù)據(jù)庫）檢索目標風味物質，并篩選包含目標風味物質的Entry編號選項；（2）通路選項中確定目標風味物質的代謝圖譜，并獲取該代謝途徑的可視化圖譜；（3）結合代謝途徑所涉及相關酶信息及其文獻報道，確定催化反應的關鍵酶。

1.3.2 關鍵酶表達微生物查詢

通過美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫獲得催化酶微生物信息，確定產(chǎn)目標物質潛在的微生物種屬。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵液制備

分別挑取不同供試菌株，于50mLMRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃靜置厭氧培養(yǎng)至對數(shù)期，制備種子液備用。分別接種1 mL種子液于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃靜置厭氧培養(yǎng)5～7 d，檢測發(fā)酵液中正丙醇含量。

1.3.4 正丙醇含量測定

采用頂空-氣相色譜-質譜聯(lián)用儀法測定發(fā)酵液中的正丙醇含量，具體方法為：（1）樣品前處理：于20 mL頂空瓶中加入2gNaCl和5mL菌體發(fā)酵液，加入3 μL叔戊醇乙醇溶液作為內(nèi)標。（2）頂空條件：孵育室溫度70℃，孵育時間10min，振搖頻率高，定量環(huán)溫度100℃，傳輸線溫度130℃，進樣體積3mL，GC循環(huán)時間22min。（3）氣相色譜分析條件：DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度230 ℃，分流比30∶1，載氣為氦氣（He），流速為0.8 mL/min。柱溫采用程序升溫：起始溫度40℃，保持1 min后以1℃/min升溫至45℃，然后以35℃/min升溫至220℃，保持7 min，運行時間18 min。（4）質譜分析條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250℃。掃描質量范圍33～350 amu。采集模式：選擇離子掃描（selected ion monitoring，SIM），溶劑延遲2 min。SIM參數(shù)：組1為1-丙醇，繪圖離子為59。（5）正丙醇定性、定量方法：采用標準譜圖比對和標準品比對，對目標物進行定性，內(nèi)標標準曲線法進行定量。

2 結果與分析

2.1 催化產(chǎn)正丙醇關鍵酶

通過在KEGG代謝網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫中對正丙醇產(chǎn)生途徑查詢，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生途徑為丙酸代謝途徑（Map00640）中由丙醛代謝產(chǎn)生正丙醇，其代謝通路如圖1所示。

從圖1可以看出，在丙酸代謝途徑中，正丙醇存在一條代謝通路，為1,2-丙二醇在丙二醇脫水酶的作用下生成丙醛，從而丙醛在1,3-丙二醇脫氫酶和1-丙醇脫氫酶的作用下代謝產(chǎn)生正丙醇。

相關報道指出[19-20]，在大腸桿菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）中導入丙二醇脫水酶與醇脫氫酶，能夠代謝丙二醇產(chǎn)生正丙醇。因此結合代謝通路確定丙二醇脫水酶、1,3-丙二醇脫氫酶和1-丙醇脫氫酶為催化產(chǎn)生正丙醇的關鍵酶。

2.2 關鍵酶表達微生物

通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢能夠表達上述3種關鍵酶的微生物，在NCBI數(shù)據(jù)庫中能夠分別表達上述3種酶的微生物種屬，如表1所示。

表1 NCBI中表達關鍵酶的微生物Table 1 Microorganisms expressing key enzymes in NCBI

發(fā)現(xiàn)共計17個微生物屬能夠同時表達上述3種關鍵催化酶，具體如表2所示，表2中所示微生物種屬為供試菌株的篩選提供范圍。

表2 同時表達3種關鍵酶的微生物屬Table 2 Genera of microorganisms simultaneously expressing 3 key enzymes

2.3 供試菌株選擇

針對不同香型白酒微生物研究表明，上述17個微生物屬除李斯特菌屬（Listeria）和甲烷嗜桿菌屬（Metakosakonia）未見報道外，其余15個微生物屬分別在不同香型白酒釀造中有檢出，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）與芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物占絕對優(yōu)勢地位[21-31]；且豐度較高的微生物對白酒風味具有明顯的貢獻作用[27]。柏永昊等[14，18]研究發(fā)現(xiàn)，白酒中存在能夠代謝產(chǎn)正丙醇的Bacillus屬微生物；而關于白酒中Lactobacillus屬微生物代謝產(chǎn)正丙醇的研究尚未見報道。為進一步確認白酒釀造過程中正丙醇的優(yōu)勢微生物來源，本研究以Lactobacillus屬微生物為研究對象驗證其產(chǎn)正丙醇的能力。

挑選6株已保藏且報道的在不同香型白酒釀造過程占優(yōu)勢地位的Lactobacillus屬微生物作為實驗菌株[32-37]，驗證其代謝產(chǎn)正丙醇的能力。具體種屬為布赫內(nèi)氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、面包乳桿菌（Lactobacillus panis）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、橋乳桿菌（Lactobacillus pontis）、耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentose），編號分別為Lac1～Lac6。

2.4 乳酸菌產(chǎn)正丙醇結果分析

2.4.1 發(fā)酵液中正丙醇含量分析方法的建立

依據(jù)HS-GC-MS方法對發(fā)酵液進行分析，通過譜庫譜圖比對和標準品比對，確認可檢出內(nèi)標物質叔戊醇和目標物質正丙醇。采用HS-GC-MS法測得的發(fā)酵液的總離子流色譜圖見圖2。

圖2 乳桿菌發(fā)酵液正丙醇含量HS-GC-MS分析的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of fermentation broth of Lactobacillusdetected by HS-GC-MS

將配制好的系列標準溶液進行靜態(tài)頂空氣-相色譜-質譜分析，數(shù)據(jù)分析后得到正丙醇標準曲線，并以正丙醇與叔戊醇的峰面積比值為x，發(fā)酵液中正丙醇含量為y，計算得到該標準曲線的回歸方程y=24.965 5x+0.301 1，其線性范圍為0.79～159.12 mg/L，線性關系良好（R2=0.999 9），平均加標回收率為102.70%。以信噪比為10為標準，計算得到該方法的定量限為0.386 mg/L。

2.4.2 正丙醇含量分析

將制備好的6株供試菌株種子液1mL分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，以不接菌作為空白對照（CK），37℃厭氧發(fā)酵5～7 d，其發(fā)酵液中正丙醇含量檢測結果如圖3所示。

圖3 乳桿菌發(fā)酵液中正丙醇含量Fig.3 1-propanol content in fermentation broth ofLactobacillus

由圖3可知，接種6株Lactobacillus屬微生物的發(fā)酵液均有正丙醇的檢出，其中面包乳桿菌（Lactobacillus panis）發(fā)酵液檢出量最高，其含量為263.7 mg/L，是目前已有文獻報道的白酒產(chǎn)正丙醇的酵母菌[15]與芽孢桿菌[18]純菌發(fā)酵液中正丙醇含量的3.6倍與4.5倍。該結果表明白酒釀造過程中存在能夠代謝產(chǎn)正丙醇的乳桿菌屬微生物。

3 結論

本研究闡述了一種目標風味物質微生物溯源的新方法。通過KEGG數(shù)據(jù)庫明確目標風味物質代謝途徑及其催化的關鍵酶；并利用NCBI數(shù)據(jù)庫確定表達關鍵酶的微生物種類信息，同時對樣品進行微生物群落結構分析，對比樣品微生物群落結構與表達關鍵酶微生物信息，將分類地位相同的微生物作為目標菌株；以此微生物種屬開展篩選與功能研究。該方法具有工作量小、目的性強等優(yōu)勢，同時也可為其他食品發(fā)酵過程中產(chǎn)特征風味物質的微生物溯源提供新思路。

本研究利用上述方法開展白酒中產(chǎn)正丙醇微生物的補充溯源，發(fā)現(xiàn)在純菌發(fā)酵條件下，研究的6株乳桿菌屬（Lactobacillus）均能代謝生成正丙醇，其中面包乳桿菌（Lactobacillus panis）正丙醇產(chǎn)量最高，為263.7 mg/L，顯著高于已報道的白酒釀造過程中酵母菌與芽孢桿菌的正丙醇產(chǎn)量。該研究結果表明，乳酸桿菌是白酒釀造過程中正丙醇的另一重要微生物來源，但由于白酒釀造體系中復雜的微生物組成、發(fā)酵環(huán)境與營養(yǎng)條件對微生物的代謝產(chǎn)物種類與含量均有重要影響，因此，乳桿菌屬微生物在釀造過程中的正丙醇代謝能力及貢獻仍需進一步探索，這將為調(diào)控白酒中正丙醇的含量奠定理論基礎。