龔 林，劉小麗，許慧瓊，梁建生

(武漢市疾病預(yù)防控制中心消毒與病媒生物防制所，湖北 武漢 430015)

由于碳青霉烯類抗生素抗菌活性強(qiáng)且抗菌譜廣，逐漸成為臨床上治療重癥感染的主要藥物[1]。但是，隨著碳青霉烯類藥物的廣泛應(yīng)用，耐碳青霉烯類藥物的細(xì)菌不斷增加，降低了該類藥物的治療效果[2]。細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的主要機(jī)制之一是產(chǎn)碳青霉烯酶，通過分析產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的分子流行特征，對(duì)預(yù)防和控制耐藥菌的產(chǎn)生和耐藥基因的傳播具有重要意義。本研究對(duì)武漢兩所醫(yī)院臨床分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，為臨床采取合理的防控措施提供實(shí)驗(yàn)室參考依據(jù)[3]。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集武漢兩所醫(yī)院2018年1—10月臨床分離的非重復(fù)CRKP共42株。對(duì)亞胺培南，美羅培南和厄他培南3種藥物其中的1種耐藥，定義為耐碳青霉烯類藥物。

1.2 儀器與試劑 主要儀器: PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司),全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃公司),脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀(美國(guó)伯樂公司),凝膠成像儀(美國(guó)UVP公司)。主要試劑: 細(xì)菌DNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)，PCR反應(yīng)試劑盒(日本Takara公司)。

1.3 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)完成，大腸埃希菌ATCC 25922作為對(duì)照菌。藥敏分析結(jié)果按2018年版美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

1.4 碳青霉烯酶表型檢測(cè) 采用Carba NP試驗(yàn)對(duì)CRKP菌株產(chǎn)碳青霉烯酶情況進(jìn)行初篩。制備Carba NP溶液A和Carba NP溶液B，然后刮取平板上隔夜培養(yǎng)的受試菌株，分別加入裝有Carba NP溶液A和Carba NP溶液B的離心管中，(35±2)℃孵育，孵育過程中每隔一段時(shí)間觀察結(jié)果。結(jié)果判定：(1)若溶液A為紅色或橙紅色，且溶液B為淺橙色、黃色或深黃色，則結(jié)果判定為陽性；(2)若溶液A為紅色或橙紅色，且溶液B為紅色或橙紅色，則結(jié)果判定為陰性；(3)若溶液A為橙色、淺橙色、黃色或深黃色，則結(jié)果判定為無效，應(yīng)結(jié)合其他試驗(yàn)判定。

1.5 碳青霉烯耐藥基因擴(kuò)增 采用細(xì)菌DNA 提取試劑盒并按照試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)方法提取菌株DNA。采用普通PCR 方法擴(kuò)增常見碳青霉烯耐藥基因(包括KPC、VIM、IMP、NDM、OXA-48)。依據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[4-8]設(shè)計(jì)引物和PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系共50 μL，包括PCR反應(yīng)試劑mix 25 μL，上、下游引物各1 μL、DNA模板1 μL，最后加H2O補(bǔ)足體積。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，選取陽性產(chǎn)物條帶送往生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 質(zhì)粒接合試驗(yàn) 分別取隔夜培養(yǎng)的供體菌(攜帶碳青霉烯耐藥基因的CRKP)和受體菌(大腸埃希菌J53 AZr)菌液，混合后于35 ℃培養(yǎng)4 h，然后接種于雙抗LB平板(含疊氮化合物100 mg/L，亞胺培南1.5 mg/L)上篩選接合轉(zhuǎn)移子[9]。將雙抗平板上生長(zhǎng)的菌株作菌落PCR試驗(yàn)，若PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性，則可判定為接合試驗(yàn)成功。

1.7 菌株間親緣關(guān)系分析 通過脈沖場(chǎng)凝膠電泳試驗(yàn)(PFGE) 分析產(chǎn)碳青霉烯酶基因CRKP菌株的親緣關(guān)系。菌株包埋入膠塊后，經(jīng)裂解和清洗，使用限制性內(nèi)切酶XbaI 進(jìn)行酶切，然后在0.5×TBE 緩沖液中電泳18.5 h。電泳參數(shù)為電壓6 V/cm、溫度14 ℃、脈沖時(shí)間6～36 s。采用BioNumerics軟件分析電泳凝膠成像圖譜，圖譜結(jié)果判讀依據(jù)Tenover等[10]建議的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 菌株來源 42株CRKP，其中分離自痰28株(66.7%)，分泌物6株(14.3%)，尿5株(11.9%)，血2株(4.8%)和穿刺液1株(2.4%)。來源科室分別為ICU 19株(45.2%)，呼吸內(nèi)科11株(26.2%)，肝膽外科4株(9.5%)，普通外科4株(9.5%)，腦血管外科2株(4.8%)，急診科和神經(jīng)內(nèi)科各1株(各占2.4%)。

2.3 碳青霉烯酶表型和基因檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)Carba NP試驗(yàn)檢測(cè)，碳青霉烯酶陽性率為33.3%(14/42)。PCR結(jié)果顯示，13株耐藥基因檢測(cè)陽性，其中NDM陽性10株， KPC陽性3株。所有攜帶碳青霉烯酶基因的菌株Carba NP試驗(yàn)結(jié)果均為陽性。所有菌株均未檢出VIM、IMP和OXA-48基因。NDM和KPC陽性產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序比對(duì)后，分別確定為NDM-1基因和KPC-2基因。Ⅰ醫(yī)院檢出5株NDM-1陽性菌株，Ⅱ醫(yī)院檢出5株NDM-1和3株KPC-2陽性菌株。見表1。

圖1 42株肺炎克雷伯菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率

編號(hào)醫(yī)院來源科室Carba NP試驗(yàn)?zāi)退幓蚓幪?hào)醫(yī)院來源科室Carba NP試驗(yàn)?zāi)退幓騑H1Ⅰ尿普外科+NDM-1WH22Ⅱ痰ICU+KPC-2WH2Ⅰ尿普外科-WH23Ⅱ尿ICU+KPC-2WH3Ⅰ痰ICU-WH24Ⅱ分泌物肝膽外科-WH4Ⅰ尿普外科-WH25Ⅱ分泌物呼吸內(nèi)科-WH5Ⅰ痰急診科+WH26Ⅱ痰呼吸內(nèi)科+NDM-1WH6Ⅰ痰神經(jīng)內(nèi)科-WH27Ⅱ痰ICU-WH7Ⅰ痰ICU+NDM-1WH28Ⅱ痰呼吸內(nèi)科+NDM-1WH8Ⅰ痰ICU+NDM-1WH29Ⅱ痰腦血管外科-WH9Ⅰ痰ICU-WH30Ⅱ痰ICU-WH10Ⅰ痰ICU-WH31Ⅱ穿刺液肝膽外科+NDM-1WH11Ⅰ痰ICU-WH32Ⅱ分泌物ICU-WH12Ⅰ尿普外科+NDM-1WH33Ⅱ痰ICU-WH13Ⅰ痰ICU-WH34Ⅱ痰腦血管外科-WH14Ⅰ痰ICU-WH35Ⅱ痰ICU-WH15Ⅰ分泌物呼吸內(nèi)科-WH36Ⅱ痰呼吸內(nèi)科-WH16Ⅰ分泌物ICU-WH37Ⅱ痰呼吸內(nèi)科+NDM-1WH17Ⅰ痰ICU+NDM-1WH38Ⅱ痰呼吸內(nèi)科-WH18Ⅱ痰呼吸內(nèi)科-WH39Ⅱ痰呼吸內(nèi)科-WH19Ⅱ痰呼吸內(nèi)科-WH40Ⅱ血ICU+NDM-1WH20Ⅱ痰ICU+KPC-2WH41Ⅱ痰呼吸內(nèi)科-WH21Ⅱ血肝膽外科-WH42Ⅱ分泌物肝膽外科-

2.4 質(zhì)粒接合試驗(yàn)和菌株藥敏結(jié)果 10株NDM-1陽性CRKP菌株與大腸埃希菌J53的質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)獲得了9個(gè)接合子，僅WH12 CRKP菌株未能接合成功。供體菌、接合子與受體菌藥敏結(jié)果顯示，除對(duì)氨曲南敏感外，所有接合子對(duì)絕大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，但耐藥水平較供體菌有所降低。部分接合子對(duì)氨基糖苷類、氟喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類藥物敏感，但MIC值高于受體菌。3株KPC-2陽性菌株均接合成功，接合子對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類藥物均耐藥，對(duì)阿莫西林/克拉維酸、氨基糖苷類、四環(huán)素類藥物均敏感。

2.5 菌株間親緣關(guān)系分析 PFGE分析結(jié)果顯示，10株NDM-1陽性CRKP菌株圖譜共分為6個(gè)型別，分別定義為A、B、C、D、F、G型；其中D型、E型各3株，C型和F型分別各2株，A型、B型和G型各1株，其中3株D型均來自Ⅱ醫(yī)院呼吸內(nèi)科，2株F型均來自于Ⅰ醫(yī)院的ICU。3株KPC-2陽性菌株均為E型，來自于Ⅱ醫(yī)院的ICU。見圖2。

圖2 攜帶碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌PFGE 分析

3 討論

肺炎克雷伯菌常定植于人體腸道和呼吸道，可引起消化道、血液、呼吸道、皮膚軟組織等部位感染，是臨床上常見的條件致病菌之一[11]。碳青霉烯類藥物作為廣譜抗菌藥物，是治療肺炎克雷伯菌的重要藥物之一，隨著碳青霉烯類藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，CRKP逐年增加。本研究中分離的CRKP菌株大部分來源于ICU，患者病情嚴(yán)重、長(zhǎng)期住院、免疫力低下，較容易感染耐藥菌。同時(shí)，CRKP多分離自痰標(biāo)本，提示此類耐藥菌常定植于呼吸道，引起呼吸系統(tǒng)感染。NDM-1和KPC-2的檢出率分別為23.8%(10/42)和7.1%(3/42),低于既往研究[12-14]的數(shù)據(jù)，提示產(chǎn)NDM-1和KPC-2的CRKP菌株在此兩所醫(yī)院流行率相對(duì)較低。另外，也可能是醫(yī)院監(jiān)測(cè)系統(tǒng)不完善，未能發(fā)現(xiàn)所有產(chǎn)酶菌株。

本研究顯示，14株CRKP菌株Carba NP試驗(yàn)初篩碳青霉烯酶陽性，經(jīng)過PCR檢測(cè)顯示其中有13株CRKP菌株擴(kuò)增出碳青霉烯酶基因，僅有1株CRKP菌株未能擴(kuò)增出碳青霉烯基因，表明Carba NP試驗(yàn)在檢測(cè)碳青霉烯酶時(shí)具有很高的靈敏度和特異度。Vasoo等[15]研究結(jié)果表明，Carba NP試驗(yàn)對(duì)常見的碳青霉烯酶(OXA-48除外)檢出率很高，靈敏度和特異度接近100%。與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論類似，表明該方法可以用于對(duì)碳青霉烯酶進(jìn)行初篩。

本研究13株產(chǎn)碳青霉烯酶CRKP菌株中有12株成功進(jìn)行了質(zhì)粒接合試驗(yàn)，表明耐藥基因可通過質(zhì)粒介導(dǎo)在不同細(xì)菌間水平傳播。對(duì)接合子和受體菌的藥敏結(jié)果進(jìn)行分析，攜帶NDM和KPC基因的菌株對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類等抗菌藥物的MIC均相對(duì)較高。對(duì)接合子和供體菌的藥敏結(jié)果進(jìn)行分析，供體菌除了攜帶碳青霉烯基因外，可能還獲得了其他耐藥元件、耐藥基因或其他耐藥機(jī)制等，使得菌株產(chǎn)生更高水平的耐藥。

本研究對(duì)13株攜帶NDM-1基因和KPC-2基因的CRKP進(jìn)行PFGE分型，結(jié)果顯示10 株攜帶NDM-1基因CRKP菌株共分為6個(gè)型，無明顯優(yōu)勢(shì)型；然而，3株攜帶KPC-2基因CRKP菌株則為同一型別，且集中分布于ICU。PFGE分型結(jié)果提示，兩所醫(yī)院可能存在KPC-2基因克隆傳播，NDM-1基因克隆傳播和水平傳播并存的現(xiàn)象。此兩種方式會(huì)加速碳青霉烯酶基因在醫(yī)院內(nèi)和醫(yī)院間的傳播，從而引起更多的肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物產(chǎn)生耐藥。

綜上所述，兩所醫(yī)院分離的CRKP與其攜帶的碳青霉烯酶基因NDM-1和KPC-2有關(guān)，且該類基因可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移在細(xì)菌間進(jìn)行水平傳播。因此，應(yīng)高度重視碳青霉烯酶基因?qū)е碌奶记嗝瓜╊惸退嶽16]，制定和實(shí)施有效的多重耐藥菌防控措施，從而可減少其在醫(yī)院內(nèi)和醫(yī)院間的傳播。