曾 俊 陳偉洲 陳澤攀 劉浩然

廣東紫菜基因cDNA克隆與表達(dá)分析*

曾 俊 陳偉洲①陳澤攀 劉浩然

(汕頭大學(xué) 廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 汕頭 515063)

為探索廣東紫菜()葉狀體基因在溫度刺激下機(jī)體耐溫相關(guān)分子機(jī)制，為廣東紫菜的栽培生產(chǎn)提供技術(shù)參考，本研究利用RACE技術(shù)獲得了廣東紫菜基因()全長序列，并在此基礎(chǔ)上采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，研究廣東紫菜葉狀體分別在不同溫度(22℃、27℃和31℃)條件下處理0、1/6、1/2、1、6、12、24和36 h后基因的差異表達(dá)。結(jié)果顯示，基因序列長2004 bp，包含一個1866 bp的開放閱讀框，可編碼621個氨基酸，預(yù)測分子量為67.7 kDa，理論等電點(diǎn)為4.87?；虮磉_(dá)水平定量分析表明，溫度對基因表達(dá)水平有顯著影響，基因在不同溫度的表達(dá)水平變化趨勢基本一致，均呈現(xiàn)先上調(diào)后下降的趨勢，且均于1 h表達(dá)量到達(dá)最高水平，其中，在31℃ 1 h表達(dá)量最高，為未經(jīng)高溫處理組的11倍，說明基因在應(yīng)答高溫脅迫中發(fā)揮著重要的作用。

廣東紫菜；高溫脅迫；；cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)；qRT-PCR

生物有機(jī)體受到外界有害因素刺激時，很多基因表達(dá)會受到抑制，而熱休克基因在刺激下表達(dá)增強(qiáng)，產(chǎn)生的蛋白稱熱休克蛋白或熱激蛋白(Hsp)(王宇萍等, 2010)。Hsp在果蠅()中首次發(fā)現(xiàn)(Ritossa, 1962)。Tisserers等(1974)從果蠅幼體中分離出6種新的蛋白質(zhì)，命名為熱激蛋白。至今，大量研究證明，主要的熱激蛋白都有分子伴侶的功能。而Hsp70是Hsp家族中進(jìn)化上最保守和研究最多的一類熱激蛋白，按表達(dá)情況可將Hsp70蛋白分為結(jié)構(gòu)型熱激蛋白Hsc70和誘導(dǎo)型熱激蛋白Hsp70兩大類；按定位情況可將Hsp70蛋白分為定位于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和質(zhì)體的4個亞家族(Guy, 1998)。Hsp70蛋白的功能十分廣泛，具有多種生物學(xué)功能，例如，Hsp70是主要分子伴侶蛋白之一(Bukau, 2013; Mayer, 2013)，與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，具有調(diào)控細(xì)胞增殖的功能(Zhang, 2002)，參與細(xì)胞保護(hù)、提高細(xì)胞應(yīng)激耐受性(Mayer, 2005)，抗細(xì)胞凋亡(Snoeckx, 2001)等。目前，對紫菜屬海藻基因的研究工作主要集中在栽培種類壇紫菜() (賴曉娟等, 2014)和條斑紫菜()(周向紅等, 2011)以及非傳統(tǒng)栽培種長紫菜()、皺紫菜() (鄭紅妍, 2017)和列紫菜() (San, 2015)，為深入研究紫菜基因的功能奠定了基礎(chǔ)，而對廣東紫菜()基因的研究尚未見相關(guān)報道。

廣東紫菜屬紅藻門(Phodophyta)、紅藻綱(Rhodophyceae)、紅毛菜亞綱(Bangiophycidae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紫菜屬()，主要分布于廣東等沿岸海區(qū)(鄭寶福等, 2009; Tseng, 1978)。在自然環(huán)境中，影響紫菜生長的環(huán)境因素很多，如高溫、鹽脅迫的、干出失水等(李曉蕾等, 2017)。其中，溫度是影響紫菜生長的最重要的環(huán)境因子，直接影響紫菜的生長狀態(tài)以及品質(zhì)(李兵等, 2013)。廣東紫菜有一定的高溫適應(yīng)性(王永川等, 1978、1982)，而大量證據(jù)表明，Hsp70蛋白家族在藻類適應(yīng)環(huán)境的過程中起重要的作用，例如，壇紫菜在29℃高溫脅迫3 h后，5條基因的表達(dá)水平都顯著升高；在極度干燥的條件下，壇紫菜基因表達(dá)水平顯著上升，表現(xiàn)出適應(yīng)高溫脅迫和干燥脅迫的作用(Ji, 2015)。Hsp70蛋白家族與廣東紫菜的高溫適應(yīng)性也直接相關(guān)，因此，研究廣東紫菜()基因具有重要意義。本研究開展基因的全長克隆，并在此基礎(chǔ)上，研究分析其在不同溫度脅迫過程中的差異表達(dá)，以期從基因表達(dá)水平初步揭示廣東紫菜對高溫脅迫的響應(yīng)特點(diǎn)，為廣東紫菜的栽培生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料預(yù)培養(yǎng)與脅迫處理

廣東紫菜于2016年11月采集于廣東省汕頭市南澳縣深澳灣海區(qū)(23°28?52?N, 117°06?35?E)的人工栽培網(wǎng)簾，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選健康、長度一致(約為10~15 cm)的藻體進(jìn)行滅菌海水清洗處理，在溫度20℃和光照強(qiáng)度約90 μmol photons/(m2·s)的條件下用砂濾后抽濾的自然海水(鹽度30)暫養(yǎng)2 d。

取1組廣東紫菜用濾紙吸干，液氮迅速預(yù)冷，保存至–80℃冰箱，用于基因的全長克隆。另取一組廣東紫菜在智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行高溫脅迫實(shí)驗(yàn)，用于基因表達(dá)水平的實(shí)時熒光定量PCR分析。參照南澳島海區(qū)廣東紫菜自然生長的特性，以22℃為對照組，海水鹽度為30，光照強(qiáng)度為90 μmol photons/(m2·s)，設(shè)置2個高溫組：27℃和31℃，在智能光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫脅迫處理0、1/6、1/2、1、6、12、24和36 h后分別取樣，液氮迅速保存后至–80℃冰箱，每個處理設(shè)置3個平行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物及序列 同源擴(kuò)增、RACE擴(kuò)增、陽性克隆篩選以及熒光定量PCR分析所采用的引物用Primer Premier 5軟件設(shè)計，由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。200 μl UPM：Long UPM (10 μmol/L)8 μl，Short UPM (10 μmol/L)40 μl，ddH2O 152 μl。

1.2.2 廣東紫菜總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 用于全長克隆的總RNA提取按照RNAiso Plus Total RNA(TaKaRa)提取試劑說明書(Raha, 1990)進(jìn)行操作，提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢查完整性，并利用NanoDrop2000超微量分光光度計測定RNA濃度及純度，判斷核酸和蛋白質(zhì)的污染情況。選取質(zhì)量良好的RNA按照PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)和SMARTer RACE 5?/3? cDNA Kit Components(TaKaRa)的操作說明書(Tian, 2013; Tang, 2013; Freeman, 2013)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，分別得到cDNA、5?RACE cDNA及3?RACE cDNA，保存至-20℃冰箱，分別用于基因中間片段的克隆以及5?RACE和3?RACE擴(kuò)增。

表1 實(shí)驗(yàn)中引物的名稱和序列

Tab.1 Name and sequence of primers used in the experiment

用于熒光定量檢測的總RNA提取按照RNAfast200-總RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)的說明書(武榮等, 2011)進(jìn)行操作，利用NanoDrop2000超微量分光光度計測定RNA濃度及260 nm/280 nm值，選取質(zhì)量良好的RNA根據(jù)PrimeScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(TaKaRa)的說明書(Zhang, 2013)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(以RNA 900 ng為基準(zhǔn))，所得的cDNA用UBC引物進(jìn)行檢驗(yàn)，保存至–20℃冰箱備用。

1.2.3基因的全長克隆 從NCBI中搜索條斑紫菜(GenBank No.: DQ497595.1)，壇紫菜(GenBank No.: DQ480726)的基因的核酸序列，進(jìn)行序列比對并找出保守區(qū)域，設(shè)計引物PF和PR (表1)。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠回收試劑盒回收，利用T-A克隆方法克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含Amp的LA固體培養(yǎng)基進(jìn)行37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于1 ml LA培養(yǎng)液中37℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)6 h，進(jìn)行菌液PCR檢測，挑取陽性克隆。將含有目的片段的陽性菌落交由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與NCBI上其他物種的基因進(jìn)行比對和同源性分析，確定為基因中間片段。

根據(jù)克隆得到的基因片段序列，分別設(shè)計5?RACE和3?RACE的特異性擴(kuò)增引物(表1)。分別以5?cDNA和3?cDNA模板進(jìn)行5?RACE和3?RACE擴(kuò)增，將RACE擴(kuò)增的目的片段切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆篩選、送樣測序。

根據(jù)基因測序獲得的基因5?和3?及中間片段序列，利用DNAman V6.0軟件進(jìn)行拼接，獲得基因全長序列。

1.2.4基因的生物信息學(xué)分析 采用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析獲得的基因的開放閱讀框和所編碼氨基酸序列；利用在線工具(http://web.expasy.org/ compute_pi/)預(yù)測該基因氨基酸序列的分子量和等電點(diǎn)；用在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測該基因氨基酸序列功能結(jié)構(gòu)域；利用InterProScan (http://www.ebi. ac.uk/interpro/)和PROSITE (https://prosite.expasy.org/)在線軟件分析該基因編碼的氨基酸序列保守位點(diǎn)及特征序列；利用PrediSi (http://www.Predisi.de)預(yù)測所得蛋白是否含有信號肽；利用NCBI網(wǎng)站上BLAST序列分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索用于同源性比對分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建的氨基酸序列；采用DNAman 6.0進(jìn)行氨基酸多重序列比對；通過MEGA 5.1軟件，構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 高溫脅迫下基因的表達(dá)分析 根據(jù)基因全長序列設(shè)計qRT-PCR正反向引物QF和QR，并以作為內(nèi)參基因(表1)。以廣東紫菜葉狀體在不同高溫脅迫條件下各時間的cDNA為模板，在Roche light Cycler 480Ⅱ儀器進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)。20 μl反應(yīng)體系：Tip Green 10 μl，Q1F 0.8 μl，Q1R 0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 6.4 μl。每次反應(yīng)均設(shè)陰性對照和無模板對照，每個反應(yīng)設(shè) 3個重復(fù)。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后從60℃緩慢升溫至95℃；40℃冷卻30 s。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對CT法(2–DD)進(jìn)行基因mRNA的表達(dá)量計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel和SPSS 13.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計分析，并采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 PgHsp70基因的克隆及序列分析

以廣東紫菜cDNA為模板，用引物PF/PR進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，1%的瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察到1條擴(kuò)增條帶，約為1100 bp(圖1a)，將其切膠回收，克隆并送去測序，得到一段1061 bp的基因序列。進(jìn)行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，其與(GenBank No.: DQ480726)的基因核酸序列同源性達(dá)99%，與(GenBank No.: DQ497595.1)的基因核酸序列同源性達(dá)到90%，進(jìn)而推斷該片段為的基因片段。

廣東紫菜通過RACE技術(shù)擴(kuò)增并測序，分別獲得長為337 bp的5?序列和606 bp的3?序列(圖1b、c)。將2條序列與之前克隆得到的基因部分序列進(jìn)行拼接，獲得長為2004 bp的基因全長序列。經(jīng)過Blast比對，確認(rèn)其為廣東紫菜的基因，命名為。通過ORF Finder軟件分析發(fā)現(xiàn)，廣東紫菜基因開放閱讀框?yàn)?866 bp，以ATG為起始密碼子，TAA為終止子，可編碼621個氨基酸，預(yù)測分子量約為67.7 kDa，理論等電點(diǎn)為4.87。5?非編碼區(qū)(5? TR)7 bp，3?非編碼區(qū)(3? UTR)131 bp(圖2)。利用InterProScan軟件分析克隆得到的基因氨基酸序列，378~534位點(diǎn)是多肽結(jié)合域(Peptide- binding domain)，527~595位點(diǎn)是C末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain)(圖2)。使用Prosite在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的氨基酸序列有家族的3條特征性序列：IDLGTTNS，VFDLGGGTFDVSVL，VVLVGGSTRIPAIQQ(圖2)。PrediSi預(yù)測軟件并未在該基因中發(fā)現(xiàn)信號肽序列。

圖1 PgHsp70基因克隆產(chǎn)物凝膠電泳

a:基因的中間片段擴(kuò)增產(chǎn)物; b:基因的5?RACE擴(kuò)增產(chǎn)物(箭頭); c:基因的3?RACE擴(kuò)增產(chǎn)物(箭頭). M: DNA marker DL 2000; C: 對照

a: Core fragment amplification product ofgenes;b: 5?RACE amplification products of(arrow); c: 3?RACE amplification products of(arrow);M: DNA marker DL 2000; C: Control

2.2 PgHsp70基因多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

廣東紫菜基因編碼的氨基酸序列經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)，與其他物種的基因有較高同源性。利用DNAman 6.0進(jìn)行氨基酸多重序列比對分析結(jié)果顯示，不同物種間的序列非常保守，其中，氨基酸序列與壇紫菜氨基酸序列相似性最高(99%)，其次分別與條斑紫菜氨基酸序列相似性達(dá)98%，與的氨基酸序列相似性達(dá)97%，與臍形紫菜() Hsp70氨基酸序列相似性達(dá)94%，與細(xì)基江蘺繁枝變種()Hsp70氨基酸序列相似性達(dá)78%(圖3)。

圖2 廣東紫菜Hsp70基因的核苷酸序列和氨基酸序列

藍(lán)色方框區(qū)域表示Hsp70蛋白家族的序列特征; 黃色方框區(qū)域表示C末端結(jié)構(gòu)域，紅色“—”表示多肽結(jié)合域; 方框所示為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)

Blue boxes represent sequences of HSP70 protein family, Yellow boxes represent C－terminal domain, Polypeptide binding domain is underlined with red “—”, Start codon(ATG) and termination codon(TAA) are shown in the box

圖3 Hsp70的氨基酸序列多重序列比對

黑色區(qū)域：相似性100%；粉紅區(qū)域：相似性≥75%；藍(lán)色區(qū)域：≥50%

Black area: Similarity is 100%; Pink area: Similarity is greater than or equal to 75%; Blue area: Similarity is greater than or equal to 50%

為了確定的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，通過MEGA 5.1軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建了及選取的17條代表性的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹結(jié)果顯示(圖4)，紅藻和藍(lán)藻親緣關(guān)系較近且聚類于葉綠體定位的Hsp70蛋白，綠藻、褐藻和陸生植物則聚類于細(xì)胞質(zhì)定位的Hsp70蛋白。其中，PgHsp70蛋白聚類于葉綠體定位的Hsp70蛋白，與壇紫菜親緣關(guān)系最近，與同屬紅藻門的其他物種親緣關(guān)系較近，與藍(lán)藻親緣關(guān)系次之，而其他藻類及陸生植物則明顯地被區(qū)分開來。

圖4 采用NJ法構(gòu)建的基于PgHsp70基因所編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 PgHsp70基因在高溫脅迫下的表達(dá)

基因在特定條件下表達(dá)水平的變化有助于了解相關(guān)基因的功能。為研究廣東紫菜對高溫脅迫的功能響應(yīng)，本研究采用熒光定量PCR技術(shù)檢測基因在不同溫度(22℃、27℃和31℃)處理下，不同時間水平(0、1/6、1/2、1、6、12、24、36 h)基因相對表達(dá)水平變化?；蛟诟邷孛{迫過程中相對表達(dá)變化趨勢見圖5，內(nèi)參為。檢測結(jié)果顯示，溫度對基因表達(dá)水平有顯著影響，基因表達(dá)量在不同溫度脅迫下隨時間變化趨勢基本一致，均呈現(xiàn)1 h之前先上調(diào)、1 h之后下調(diào)的趨勢，且均于1 h表達(dá)量到達(dá)最高水平，分別為未經(jīng)高溫處理組的3.9倍、7.1倍和11.1倍。在溫度脅迫0~1 h時，基因表達(dá)量顯著升高(<0.05)，31℃溫度組基因表達(dá)水平一直高于其他溫度組，27℃溫度組基因表達(dá)水平在1/6~1/2 h間低于22℃，在1 h時高于22℃；隨著脅迫時間的增加(1 h之后)，不同溫度基因表達(dá)量均顯著下調(diào)(<0.05)，但在高溫脅迫6~36 h之間，基因表達(dá)水平無顯著性差異(>0.05)。因此，基因在應(yīng)答高溫脅迫中發(fā)揮著重要的作用，短時間內(nèi)迅速大量表達(dá)以適應(yīng)高溫環(huán)境，在一定脅迫時間內(nèi)溫度越高，反應(yīng)越靈敏，但應(yīng)對高溫脅迫的能力有限。

圖5 廣東紫菜Hsp70基因在高溫脅迫過程中相對表達(dá)變化

3 討論

熱激蛋白是細(xì)胞受到不良環(huán)境(如干旱、洪澇、低溫、高溫、鹽漬等)刺激時被激活并表達(dá)增強(qiáng)的一類蛋白(待真真等, 2014; 陳玉婷等, 2015)。其中，Hsp70是研究最多、在生物體內(nèi)分布最廣、進(jìn)化上最保守及生物學(xué)功能多樣的一類熱激蛋白(齊妍等, 2013)。通?？煞譃?個區(qū)域：含有ATP酶結(jié)構(gòu)域的N-端高度保守區(qū)和含有多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)的C-端區(qū)域，2個區(qū)域之間由絞鏈相連(Genevaux, 2007)。編碼的氨基酸序列則一般有3條特征性序列：IDLGTTNS，VFDLGGGTFDVSVL，VVLVGGSTRIPAIQQ(鄭紅妍, 2017)。作者從廣東紫菜葉狀體中成功克隆了2004 bp的基因，ORF長度為1866 bp，可編碼621個氨基酸，預(yù)測分子量為67.7 kDa，理論等電點(diǎn)為4.87(圖2)。克隆獲得的推導(dǎo)出來的氨基酸序列與其他大多數(shù)紫菜相似，378~534位點(diǎn)是多肽結(jié)合域，527~595位點(diǎn)是C末端結(jié)構(gòu)域，也含有3條特征性序列(圖2)。該序列與其他物種的基因氨基酸序列對比顯示(圖3)，與同為南方的壇紫菜氨基酸序列相似性更是高達(dá)99%，表明其高度的保守性，其次才與北方條斑紫菜Hsp70氨基酸序列相似性達(dá)98%，表明地域位置更近，同源性可能更高。而與不同屬的細(xì)基江蘺繁枝變種Hsp70氨基酸序列相似性只有78%。與陸生植物相似性則更低，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中PgHsp70明顯地與陸生植物區(qū)分開來(圖4)，說明親緣關(guān)系越相近的物種和生境越接近的物種同源性可能越高，反之則同源性越低，可作為分子進(jìn)化的一種依據(jù)，這與劉偉等(2012)對壇紫菜基因的研究結(jié)果基本一致。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果還表明(圖4)，Hsp70蛋白按亞細(xì)胞定位不同分別聚類于一支，PgHsp70蛋白與紅藻、藍(lán)藻親緣關(guān)系較近聚類于葉綠體定位的Hsp70蛋白，說明PgHsp70蛋白定位于葉綠體中。

溫度是影響藻類生長分布的重要因素，李恒等(2013)研究表明，溫度的變化對大型海藻的生長具有顯著影響。對紫菜來說，高溫是制約粵東沿海紫菜養(yǎng)殖生產(chǎn)發(fā)展的主要因素，近年來在汕頭地區(qū)更是多次發(fā)生高溫爛菜爛苗事件，嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)刈喜嗽耘鄻I(yè)的發(fā)展。已有大量文獻(xiàn)報道和證據(jù)表明，在逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，具有提高機(jī)體抗熱性能力，例如，顧穎慧(2011)研究發(fā)現(xiàn)，耐高溫品種981龍須菜()在熱激后，的表達(dá)量明顯高于野生型龍須菜，說明是981龍須菜較野生型龍須菜耐高溫的重要因素。韓俊英等(2011)對脊尾白蝦()的研究證明，溫度可以引起脊尾白蝦的高表達(dá)，說明在動植物中均扮演抗逆境脅迫的角色。為探究在廣東紫菜高溫適應(yīng)性的作用，作者從廣東紫菜基因著手，分別在不同溫度下對廣東紫菜葉狀體進(jìn)行高溫脅迫實(shí)驗(yàn)，分析了不同溫度脅迫過程中基因表達(dá)變化趨勢。圖5的研究結(jié)果顯示，基因表達(dá)量在不同溫度脅迫下均呈現(xiàn)1 h之前先上調(diào)、1 h之后下調(diào)的趨勢，且均于1 h表達(dá)量到達(dá)最高水平。在溫度脅迫0~1 h時，基因表達(dá)量顯著升高(<0.05)，31℃溫度組基因表達(dá)水平一直高于其他溫度組，27℃溫度組基因表達(dá)水平在1/6~1/2 h間低于22℃，在1 h時高于22℃；脅迫1 h之后，不同溫度基因表達(dá)量均顯著下調(diào)(<0.05)。說明對于高溫脅迫反應(yīng)非常迅速，短時間內(nèi)大量積累表達(dá)，溫度越高，反應(yīng)越強(qiáng)烈，隨著脅迫時間的推移，表達(dá)量下降，該研究結(jié)果與現(xiàn)有的多數(shù)文獻(xiàn)報道情況基本一致(Ji, 2015)。由此，作者認(rèn)為應(yīng)答高溫脅迫的調(diào)節(jié)作用機(jī)制可能一樣。當(dāng)高溫脅迫時，機(jī)體受到溫度刺激造成某些功能蛋白受到抑制，從而激活基因，并使其表達(dá)量快速大量上調(diào)以維持功能蛋白穩(wěn)態(tài)，一方面，當(dāng)大量表達(dá)時受到自身的反饋抑制，使其開始下調(diào)，另一方面，脅迫持續(xù)進(jìn)行使機(jī)體長時間處于亞健康狀態(tài)時，超越了維持機(jī)體功能蛋白穩(wěn)態(tài)的限度，各種生理功能開始受到影響，表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)。當(dāng)然，一個機(jī)體的響應(yīng)調(diào)控是復(fù)雜多變的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)比作者所述的復(fù)雜，但無論如何，對維持生物體抗脅迫動態(tài)平衡的作用十分重要，其開發(fā)利用對高溫地區(qū)紫菜栽培生產(chǎn)乃至各個領(lǐng)域都有不容忽視的現(xiàn)實(shí)意義。

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The cDNA Cloning and Expression Analysis of theGene from

ZENG Jun, CHEN Weizhou①, CHEN Zepan, LIU Haoran

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Biotechnology, Shantou University, Shantou 515063)

In order to explore the molecular mechanisms of thegene in, we have stimulated it with high temperature stresses. The aim was to provide technical references for the cultivation of. The full-length ofwas obtained by rapid amplification of cDNA ends technical (RACE). On this basis, the expression ofwith the different temperature (22℃, 27℃, and 31℃) stresses after 0, 1/6, 1/2, 1, 6, 12, 24, and 36 h were detected using quantitative real-time PCR. The results showed that the full-length cDNA ofwas 2004 bp, including an open reading frame (ORF) of 1866 bp, encoding a polypeptide of 621 amino acids. The molecular mass of the deduced amino acid sequence was 67.7 kDa, with an estimated pI of 4.87. The expression of the, as measured by qRT-PCR, can be significantly induced by high-temperature stress. The three kinds of expression profiles forwere similar at different times, and all of them significantly increased first and then reached their maximum levels after one hour, and then dramatically decreased. Compared to the temperature stress of 22℃and 27℃, the expression of thewith the 31℃ temperature stress reached the highest level after being challenged for 1 h and was 11-fold higher than the normal. These results suggested thatplays an essential role in response to high-temperature stresses.

; High temperature stress;; Rapid amplification of cDNA ends (RACE); Quantitative real-time PCR

CHEN Weizhou, E-mail: wzchen@stu.edu.cn

S917.3

A

2095-9869(2019)04-0131-09

10.19663/j.issn2095-9869.20180510001

* 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-50)資助 [This work was supported by China Agriculture Research System (CARS-50)]. 曾 俊，E-mail: 1207615382@qq.com

陳偉洲，教授，E-mail: wzchen@stu.edu.cn

2018-05-10,

2018-05-30

曾俊, 陳偉洲, 陳澤攀, 劉浩然. 廣東紫菜基因cDNA克隆與表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2019, 40(4): 131–139

Zeng J, Chen WZ, Chen ZP, Liu HR. The cDNA cloning and expression analysis of thegene from. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(4): 131–139

(編輯 馮小花)