劉瑩瑩 于珊珊 柴迎梅 林嘯鵬 祝 茜

松江鱸白介素15(TfIL-15)的結(jié)構(gòu)特征與重組表達(dá)*

劉瑩瑩 于珊珊 柴迎梅 林嘯鵬 祝 茜①

(山東大學(xué)(威海)海洋學(xué)院 威海 264209)

為研究白介素15(Interleukin-15, IL-15)在松江鱸(Heckel)先天免疫中的功能，本研究利用RACE技術(shù)克隆得到松江鱸IL-15基因(命名為TfIL-15)的全長(zhǎng)cDNA序列，其長(zhǎng)度為1140 bp，包括5￠-非編碼區(qū)(5￠-UTR) 165 bp、開放閱讀框(ORF) 522 bp和3￠UTR 453 bp。在5￠UTR區(qū)域，存在4個(gè)讀碼框外的AUG翻譯起始位點(diǎn)?；騉RF編碼173個(gè)氨基酸(aa)，其中，前59 aa為信號(hào)肽序列。成熟肽全長(zhǎng)為114 aa，預(yù)測(cè)分子量為12.975 kDa，理論等電點(diǎn)為5.15。同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，魚類IL-15變異程度較高，TfIL-15與其他魚類IL-15同源性在23%~61%之間。多序列比對(duì)和三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建結(jié)果顯示，TfIL-15具有典型4個(gè)α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，形成二硫鍵的4個(gè)半胱氨酸高度保守。qRT-PCR分析表明，TfIL-15廣泛表達(dá)于松江鱸各組織中。腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)后，TfIL-15 mRNA在血液、皮膚、肝臟和脾臟中均上調(diào)表達(dá)。在皮膚和血液中，刺激后2 h表達(dá)量迅速上調(diào)至最高峰，分別為對(duì)照組的74倍和41倍。脾臟和肝臟在刺激后12 h分別達(dá)到對(duì)照組的3倍和18倍。肝臟中，刺激后96 h，表達(dá)量再次上調(diào)至對(duì)照組的86倍。上述結(jié)果表明，TfIL-15可能參與了松江鱸抵抗外界刺激的先天免疫過(guò)程。另外，通過(guò)構(gòu)建TfIL-15成熟肽的原核表達(dá)載體，成功獲得重組蛋白，為進(jìn)一步研究TfIL-15蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

松江鱸；白介素15(IL-15)；克隆；基因表達(dá)；重組蛋白表達(dá)

IL-15是白介素(Interleukin, IL)家族的重要成員之一，它與IL-2、GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)等，同屬于4α螺旋細(xì)胞因子家族(Lodolce, 2002)。轉(zhuǎn)錄水平的IL-15存在于多種類型細(xì)胞和組織器官中，包括表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及心臟、肺、脾和骨骼肌等(Carson, 1995; Lee, 1996)。但蛋白水平的IL-15在血清或培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中卻很難被檢測(cè)到。這種現(xiàn)象與IL-15基因的蛋白表達(dá)受嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控相關(guān)，這些調(diào)控方式包括5￠-UTR多個(gè)翻譯起始位的存在、特殊的信號(hào)肽及羧基末端的某些結(jié)構(gòu)等(Bamford, 1996、1998; Kurys, 2000)。IL-15是一種多效細(xì)胞因子，具有增強(qiáng)淋巴細(xì)胞活性、促進(jìn)粒細(xì)胞吞噬(Ratthé, 2004)和NK細(xì)胞發(fā)育并增強(qiáng)其細(xì)胞毒性的作用(Fehniger, 2001; Lodolce, 2002)。此外，IL-15還具有刺激T細(xì)胞/B細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)免疫球蛋白分泌、刺激特異性抗原產(chǎn)生、誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白表達(dá)等多種功能(王東勇等, 1996)。

盡管功能多樣，但由于白介素等細(xì)胞因子在趨異進(jìn)化過(guò)程中的變異程度相當(dāng)高，導(dǎo)致魚類相關(guān)基因的開發(fā)難度加大，免疫功能研究相對(duì)滯后(貝錦新, 2006)。2004年之前，硬骨魚IL-15的相關(guān)研究工作幾乎未見報(bào)道。隨著紅鰭東方鲀()、黑青斑河豚()和斑馬魚()等物種基因組計(jì)劃的完成，一系列細(xì)胞因子包括IL-15才開始被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和鑒定(Bei, 2006; Fang, 2006; Gunimaladevi, 2007)。除了以上3種魚，目前，lL-15也僅在虹鱒()、三刺魚()、金頭鯛()、條石鯛()、露斯塔野鯪(, Hamilton)等少數(shù)魚類中克隆得到(方瑋, 2009; Das, 2015; Pérez-Cordón, 2014; Wang, 2007)。研究發(fā)現(xiàn)，魚類lL-15可以由多種組織和細(xì)胞產(chǎn)生，組織分布廣泛；受到不同誘導(dǎo)物免疫刺激后，lL-15表達(dá)上調(diào)，但上調(diào)時(shí)間和不同組織的表現(xiàn)有所不同(貝錦新, 2006;方瑋, 2009)。此外，lL-15還參與了魚體對(duì)抗寄生蟲的免疫反應(yīng)(Pérez-Cordón, 2014; Das, 2015)。虹鱒體外重組表達(dá)lL-15蛋白能誘導(dǎo)虹鱒脾臟細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ (Wang, 2007)。紅鰭東方鲀重組表達(dá)的lL-15，能活化魚的外周血白細(xì)胞、小鼠T淋巴細(xì)胞(CTLL-2)、魚的頭腎細(xì)胞和胸腺細(xì)胞，說(shuō)明重組蛋白具有活化增殖免疫細(xì)胞的生物學(xué)功能(貝錦新, 2006;孫賽紅等, 2015)。這些研究為今后進(jìn)一步深入開展重組lL-15在魚類健康養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)。

松江鱸(Heckel)，隸屬于鲉形目(Scorpaeniformes)、杜父魚科(Cottidae)、松江鱸屬()，是一種近海溯河洄游的肉食性魚類(于詩(shī)群等, 2008; 陳學(xué)昭等, 2016)。近年來(lái)，由于種群數(shù)量劇減，被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)動(dòng)物(陳學(xué)昭等, 2016)。目前，關(guān)于IL-15基因在松江鱸體內(nèi)的研究尚未開展，本研究克隆了松江鱸IL-15(命名為TfIL-15)的基因，分析了序列結(jié)構(gòu)特征，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術(shù)研究了其在魚體內(nèi)的分布和免疫刺激后基因應(yīng)答情況，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)了IL-15成熟肽的重組蛋白。研究結(jié)果可進(jìn)一步豐富魚類細(xì)胞因子的研究?jī)?nèi)容，有利于闡明魚類細(xì)胞因子與魚類免疫系統(tǒng)的關(guān)系。重組蛋白的表達(dá)為進(jìn)一步開展對(duì)TfIL-15的功能研究和抗體制備奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與組織樣品制備

9~10月齡的松江鱸(體重約15~23 g)取自山東文登埠口松江鱸自然保護(hù)區(qū)，實(shí)驗(yàn)前置于充氣海水中(12℃~14℃)飼養(yǎng)1周。選取正常健康個(gè)體，麻醉后心臟取血，然后解剖取其心臟、肝臟、鰓、腸、皮膚、腎臟、脾臟、腦、卵等組織，立即放入Trizol中研磨，用于提取正常組織RNA。

LPS (Lipopolysaccharides, 脂多糖)刺激實(shí)驗(yàn)，將松江鱸平均分成2組(每組50條)，一組腹腔注50 μl (0.04 mg/kg)的LPS，對(duì)照組注射等體積無(wú)菌生理鹽水。刺激后0、2、6、12、24、48、72、96 h麻醉取樣(每次6條)，分別取其血、皮膚、肝臟和脾臟用于組織總RNA提取。

1.2 總RNA的提取和cDNA合成

依據(jù)Trizol (Invitrogen公司)操作說(shuō)明提取各樣品的組織總mRNA。cDNA第一鏈的合成參照Clontech公司SMART(Switching mechanism at 5￠end of RNA template)的指導(dǎo)說(shuō)明進(jìn)行(表1)(史曉麗等, 2018)。

1.3 TfIL-15 cDNA的全長(zhǎng)克隆

根據(jù)LPS刺激后cDNA文庫(kù)的構(gòu)建獲得TfIL-15基因的EST序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性后引物15R與5￠primer配對(duì)進(jìn)行5￠RACE克??；設(shè)計(jì)特異性前引物15F與3￠anchor R配對(duì)進(jìn)行3￠RACE克隆。所用模板為松江鱸刺激后肝臟cDNA，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。然后將PCR純化產(chǎn)物與pMD-18T載體連接，克隆測(cè)序，得到5￠端和3￠端序列片段。

1.4 TfIL-15基因的序列分析

利用軟件BioEdit對(duì)RACE獲得的兩端cDAN序列進(jìn)行拼接，以獲得TfIL-15的cDNA全長(zhǎng)序列；通過(guò)在線軟件ExPASy(http://www.au.expasy.org/)對(duì)TfIL- 15的cDNA序列進(jìn)行蛋白翻譯、等電點(diǎn)及分子量預(yù)測(cè)；TfIL-15編碼蛋白的信號(hào)肽、糖基化位點(diǎn)分別應(yīng)用SignalIP 4.1和NetNGlyc1.0 Server進(jìn)行分析；蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)在SWISS-MODEL (http://swissmodel. expasy.org/)進(jìn)行，然后用PyMol軟件進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的建構(gòu)與標(biāo)注；在NCBI下載同源序列，利用ClustalW、BioEdit和DNAman進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，利用MEGA5.0軟件以鄰位法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 組織表達(dá)分析

TfIL-15的組成型表達(dá)及刺激后表達(dá)模式的變化通過(guò)qRT-PCR分析來(lái)進(jìn)行。根據(jù)TfIL-15 cDNA序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)，以正常各組織及刺激組和對(duì)照組的不同時(shí)間點(diǎn)cDNA為模板，進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 15 s，60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)(陳學(xué)昭等, 2016)，結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。以β-actin作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品cDNA設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)和分析使用7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, 美國(guó))進(jìn)行?；虻南鄬?duì)表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示(馬慧鑫等, 2018)。差異顯著性使用T檢驗(yàn)的 方法分析，當(dāng)差異顯著性水平<0.05時(shí)認(rèn)為差異 顯著。

1.6 TfIL-15重組蛋白表達(dá)

TfIL-15基因成熟肽的兩端引物分別引入Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)，插入到pET-30a(+)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建pET-30a(+)/TfIL-15表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌克隆菌株DH5α中。經(jīng)陽(yáng)性克隆篩選后，提取構(gòu)建好的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)并進(jìn)行陽(yáng)性篩選。

將篩選出的菌落分別置于LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。次日，將過(guò)夜菌轉(zhuǎn)培養(yǎng)(1 : 100的比例)至新的液體LB培養(yǎng)基中約3 h。待其OD600 nm為0.6~0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。進(jìn)一步的超聲破碎檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蛋白以包涵體形式表達(dá)。

表1 PCR引物名稱及序列

Tab.1 PCR primers and the sequences

在確定重組蛋白表達(dá)的情況下，進(jìn)行蛋白的大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)，表達(dá)結(jié)束用PBS重懸菌體超聲破碎1 h。將超聲破碎后沉淀進(jìn)行包涵體洗滌，然后用GenScript的His-tag親和層析柱進(jìn)行純化，具體操作步驟參見Yu等(2013)的方法。重組蛋白的復(fù)性采用尿素梯度透析法，每個(gè)梯度4℃透析16 h (王彤等, 2013)。透析結(jié)束后，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的純化結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 TfIL-15基因克隆及序列分析

松江鱸IL-15全長(zhǎng)cDNA序列(圖1，GenBank登錄號(hào)為MH299805)為1140 bp，其中，5￠-非編碼區(qū)(5￠-UTR) 165 bp，開放閱讀框(ORF)522 bp，3￠-UTR 453 bp。在5￠-UTR區(qū)域，存在4個(gè)讀碼框外的AUG翻譯起始位點(diǎn)?；騉RF編碼173個(gè)氨基酸(aa)，其中，前59 aa為信號(hào)肽序列。成熟肽全長(zhǎng)為114 aa，預(yù)測(cè)分子量為12.975 kDa，理論等電點(diǎn)為5.15。成熟肽含有2個(gè)可能的N糖基化位點(diǎn)：NASM，132~134；NITV，153~155。

將TfIL-15與其他物種同源序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)TfIL-15與條石鯛(BAN84544.1)的同源性最高為61%，其次為三刺魚(NP_001254613.1) 59%，與斑馬魚同源性為23%，與魚類序列同源性在23%~61%之間。與雞(, AAF61446.1)同源性為24%，與人類IL-15(, AAA21551.1)同源性為25%，與哺乳類同源性在20%~25%之間(表2)。氨基酸序列多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，魚類IL-15與鳥類和哺乳類IL-15的成熟肽區(qū)域的同源性較信號(hào)肽高，魚類lL-15同源序列含有與鳥類和哺乳類相同的4個(gè)保守的半胱氨酸殘基(圖2)。

圖1 TfIL-15的cDNA序列及其編碼序列

下劃線標(biāo)出的分別為起始密碼子和終止密碼子。陰影部分為N-糖基化位點(diǎn)。箭頭表示信號(hào)肽切割位點(diǎn)。方框內(nèi)為5￠-UTR區(qū)讀碼框外的ATG翻譯起始位點(diǎn)

The start codon and stop codon are underlined, the N-glycosylation sites are shadowed by gray, the arrow indicates the signal peptide cleavage site, and the four out-of-frame ATG initiation codons in the 5￠UTR are indicated in the boxes

用SWISS-MODEL軟件進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)TfIL-15具有典型4個(gè)α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3A)。將TfIL-15與人類的IL-15疊合時(shí)(圖3B)，發(fā)現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)較吻合，并且二硫鍵形成位點(diǎn)相互重合。此外，松江鱸另外2個(gè)半胱氨酸形成了第3個(gè)二硫鍵(圖3A)，TfIL-15成熟肽起始氨基酸丙氨酸(A)與人類成熟肽起始氨基酸天冬酰胺(N)重合。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，所有魚類的IL-15聚為一大支，鳥類和哺乳動(dòng)物的IL-15聚為另外一大支(圖4)。

2.2 TfIL-15組織表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果表明，TfIL-15 mRNA廣泛表達(dá)于松江鱸各組織中。其中，在心臟中的表達(dá)量最高，其次為鰓(圖5)。

2.3 LPS刺激后各組織中TfIL-15基因的表達(dá)變化

腹腔注射LPS后，TfIL-15 mRNA在血液、皮膚、肝臟和脾臟中均呈上調(diào)表達(dá)(圖6)。在皮膚中，刺激后2 h表達(dá)量迅速上調(diào)至最高峰，為對(duì)照組的74倍，之后一直呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平直至刺激后96 h；在血液中，刺激后2 h表達(dá)量上調(diào)至對(duì)照組的41倍，6 h表達(dá)量下降至對(duì)照組的0.23倍，之后表達(dá)量一直顯著低于對(duì)照組直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；在脾臟中，刺激后2 h表達(dá)量開始上調(diào)至對(duì)照組的1.3倍，6 h略有下調(diào)，12 h達(dá)到對(duì)照組的3倍左右，之后恢復(fù)至對(duì)照組水平。在肝臟中，刺激后表達(dá)量逐漸上調(diào)，2 h、6 h表達(dá)量分別上調(diào)至對(duì)照組的2.2倍和2.4倍，12 h達(dá)到對(duì)照組的18倍，后恢復(fù)對(duì)照組水平；但在刺激后96 h，表達(dá)量再次上調(diào)至在對(duì)照組的86倍。

表2 脊椎動(dòng)物IL-15同源性比對(duì)分析

Tab.2 Amino acid identity of TfIL-15 with other vertebrate IL-15s

圖2 不同物種IL-15氨基酸序列的多序列比對(duì)

保守的半胱氨酸以方框表示，箭頭表示形成的二硫鍵結(jié)構(gòu)，信號(hào)肽切割位點(diǎn)以]表示。序列的GenBank登錄號(hào)分別為：人(AAA21551.1), 褐家鼠(AAB94536.1), 牛(AAA85130.1), 野豬(ABI81495.1), 雞(AAF61446.1), 黑青斑河豚(AAR25702.1), 紅鰭東方鲀(CAF28987.2), 金頭鯛(AGS55349.1), 大西洋鮭(AFB81536.1), 虹鱒魚(CAD88594.1)

The letters in box are the four conserved cysteine residues, the arrows indicate the formed two potential disulphide bonds, and semi square bracket indicates the potential signal peptide cleavage site

圖3 理論預(yù)測(cè)的TfIL-15蛋白(A)及與人類IL-15(灰色)結(jié)構(gòu)疊合圖(白色) (B)

二硫鍵位置以白色箭頭表示

The disulfides are indicated with arrows

圖4 基于不同物種IL-15的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

三刺魚的GenBank登錄號(hào)為NP_001254613.1，其余物種的GenBank登錄號(hào)同圖2，星號(hào)表示本研究物種

GenBank accession number ofis NP_001254613.1, and the others accession numbers are the same as in Fig.2. The position of TfIL-15 is marked by an asterisk

圖5 TfIL-15基因在正常組織中的表達(dá)模式

2.4 TfIL-15的原核表達(dá)及純化

將構(gòu)建的TfIL-15原核表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE，在19 kDa處出現(xiàn)一條高表達(dá)蛋白的特異性條帶，與預(yù)期大小相符(圖7)。將以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白經(jīng)親和層析柱純化、尿素梯度透析復(fù)性，可用于后續(xù)的活性檢測(cè)。

3 討論

本研究成功克隆到松江鱸IL-15基因cDNA全長(zhǎng)序列，跟其他魚類、哺乳類和鳥類的IL-15基因一樣，TfIL-15的5￠-UTR含有多個(gè)(4個(gè))讀碼框外的AUG翻譯起始位點(diǎn)(紅鰭東方鲀2個(gè)，斑馬魚4個(gè)，黑青斑河豚2個(gè)，虹鱒7個(gè))。TfIL-15含有一段很長(zhǎng)的信號(hào)肽序列，這也與其他魚類(松江鱸59 aa，紅鰭東方鲀 53 aa，斑馬魚68 aa，虹鱒65 aa，黑青斑河豚53 aa) 以及哺乳類和鳥類相似(人類含有48 aa信號(hào)肽，鳥類66 aa)。脊椎動(dòng)物IL-15這種現(xiàn)象的存在可能與IL-15的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控有關(guān)(Bamford, 1996、1998; Kurys, 2000)。TfIL-15與條石鯛I(yíng)L-15的同源性最高，盡管如此，也只有61%。與魚類同源性在23%~61%之間，可以看出不同物種魚類IL-15變異程度比較大，這可能是為了適應(yīng)不同的生長(zhǎng)環(huán)境而進(jìn)化所致(TfIL-15與同為海水或者咸淡水魚類同源性高于淡水魚類)，同時(shí)這可能也是目前魚類IL-15研究較少的原因之一。

圖6 LPS刺激后TfIL-15在不同組織的表達(dá)模式變化

A: 皮膚; B: 血; C: 肝臟 D: 脾. “*”表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(<0.05)

A: Skin; B: Blood; C: Liver; D: Spleen. The asterisks indicate significant differences (<0.05)

圖7 TfIL-15的原核表達(dá)

1: 誘導(dǎo)前細(xì)菌總蛋白; 2: 誘導(dǎo)后細(xì)菌總蛋白; 3: 超聲破碎上清液; 4: 破碎后的包涵體; M: 蛋白Marker; 5: 純化蛋白

Lane 1: Lysate ofwithout induction; Lane 2: Lysate ofwith induced with IPTG; Lane 3: Supernatant of recombinant pET-30a(+)TfIL-15 after ultrasonication; Lane 4: Sedimentation of recombinant pET-30a(+)/TfIL-15 after ultrasonication; M: Protein marker; 5: Purified protein

氨基酸序列多序列比對(duì)結(jié)果顯示，不同物種動(dòng)物IL-15的成熟肽區(qū)域的同源性較信號(hào)肽區(qū)域高，這可能由于成熟肽參與執(zhí)行細(xì)胞因子的功能，而信號(hào)肽僅參與引導(dǎo)IL-15的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與分泌。在人類IL-15成熟肽序列中存在4個(gè)半胱氨酸殘基，能形成兩對(duì)二硫鍵(Bernard, 2004)。這4個(gè)半胱氨酸在魚類lL-15同源蛋白序列中高度保守。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TfIL-15與人類IL-15三級(jí)結(jié)構(gòu)基本吻合，同屬于4α螺旋家族，TfIL-15的2個(gè)二硫鍵位置與人類二硫鍵位置重合。這說(shuō)明這些保守殘基對(duì)于維持脊椎動(dòng)物IL-15空間構(gòu)象的形成和功能發(fā)揮可能起重要作用。三刺魚、紅鰭東方鲀、金頭鯛和本研究松江鱸中，還含有另外的2個(gè)半胱氨酸，在三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，這2個(gè)半胱氨酸形成了第3個(gè)二硫鍵(圖3A)。這2個(gè)半胱氨酸是否確實(shí)形成新的二硫鍵，對(duì)于維持構(gòu)象起到怎樣的作用，尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

qRT-PCR結(jié)果顯示，TfIL-15廣泛表達(dá)于松江鱸各個(gè)組織器官中，這與以往研究魚類IL-15的表達(dá)模式相同，并且類似于人類IL-15的廣泛分布特征，這表明IL-15可能在多個(gè)生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。值得注意的是，在卵中，IL-15也表現(xiàn)出了較高的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。在對(duì)紅鰭東方鲀的研究中也發(fā)現(xiàn)，IL-15在性腺中表達(dá)量較高。Das等(2015)在對(duì)露斯塔野鯪IL-15的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-15在卵巢組織和未受精卵中也呈現(xiàn)出較高的表達(dá)量，而且在受精后發(fā)育初期表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，都表明了IL-15轉(zhuǎn)錄本以母系遺傳的形式給予待發(fā)育的后代被動(dòng)免疫保護(hù)。IL-15在卵中遺傳性的組成型高表達(dá)在卵排出體外、受精卵或幼體尚未獲得自身免疫的時(shí)候，對(duì)于魚類的體外受精及幼體發(fā)育過(guò)程中對(duì)抗水體復(fù)雜的病原微生物侵襲起著至關(guān)重要的作用。

為了進(jìn)一步探討TfIL-15在機(jī)體免疫中的作用，對(duì)LPS刺激后TfIL-15在松江鱸主要免疫組織內(nèi)的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在血液和皮膚中，LPS刺激后2 h，TfIL-15迅速上調(diào)至最高峰，在肝臟和脾中12 h達(dá)到表達(dá)高峰，比皮膚和血液稍有延遲。這可能是因?yàn)檠鹤鳛槌休d各種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的全身免疫器官，皮膚作為機(jī)體接觸外界復(fù)雜水體環(huán)境的首個(gè)免疫組織，是最直接和快速的LPS應(yīng)答和反應(yīng)器官；而脾臟是魚類紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和粒性白細(xì)胞等各種免疫細(xì)胞生產(chǎn)、貯存和成熟的主要場(chǎng)所，肝臟是魚類多種重要免疫相關(guān)蛋白的合成場(chǎng)所，因而上調(diào)時(shí)間與皮膚和血液相比有所滯后。肝臟TfIL-15MRNA在刺激后96 h又出現(xiàn)一個(gè)新的高峰，這在對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白、C-型凝集素、白介素1β等的研究中也有發(fā)現(xiàn)(Liu, 2012a、b; Yu, 2013)，原因可能是首次免疫激活的免疫細(xì)胞產(chǎn)生的新的信號(hào)分子，又激活了新的免疫細(xì)胞類型，從而再次上調(diào)表達(dá)TfIL-15基因。在對(duì)紅鰭東方鲀的研究中發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激對(duì)IL-15的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響。而在黑青斑河豚的研究中，LPS可引起幾乎所有組織IL-15表達(dá)量的上調(diào)。本結(jié)果與黑青斑河豚的研究類似，推測(cè)可能IL-15在不同魚體內(nèi)的功能存在一定的差異。魚類作為低等脊椎動(dòng)物，其適應(yīng)性免疫機(jī)制相對(duì)不完善，因此在抵御外界病原體入侵時(shí)主要依靠先天免疫發(fā)揮作用。細(xì)胞因子IL-15的上調(diào)表達(dá)正是適應(yīng)了機(jī)體所需，通過(guò)其激活淋巴細(xì)胞、促進(jìn)免疫相關(guān)蛋白表達(dá)等作用，在機(jī)體對(duì)抗外來(lái)病原入侵過(guò)程中發(fā)揮重要的抵御作用。鑒于TfIL-15可能在魚類抵抗外界刺激的免疫反應(yīng)中的作用，本研究成功地對(duì)松江鱸IL-15的成熟肽進(jìn)行了體外表達(dá)，這為進(jìn)一步研究TfIL-15蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

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Characterization and Recombinant Protein Expression of Interleukin-15 from Roughskin Sculpin,

LIU Yingying, YU Shanshan, CHAI Yingmei, LIN Xiaopeng, ZHU Qian①

(School of Marine Science, Shandong University (Weihai),Weihai 264209)

Interleukin 15 (IL-15) is an important cytokine of fish immune system. In the present study, the IL-15 cDNA named as TfIL-15 was cloned from roughskin sculpin,. The full-length of TfIL-15 cDNA is 1140 bp, which contains a 5￠-UTR (untranslated region) of 165 bp, a 3￠-UTR of 453 bp and an open reading frame (ORF) of 522 bp, encoding a polypeptide of173 amino acids (aa) with a putative 59 aa-long signal peptide. Four out-of-frame AUG initiation codons, the negative translational regulators of mammalian IL-15 genes were also detected in the 5￠-UTR of TfIL-15. The protein sequence shared 23%~61% identity with reported fish IL-15s, displaying relatively high degree of variation. TfIL-15 homologues also contained four highly conserved cysteine residues allowing the formation of two disulfide bridges along with four predicted α-helices. Phylogenetic analysis grouped roughskin sculpin with other fish on a separated branch, excluded from mammalian and avian IL-15s. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis showed that TfIL-15 was widely expressed in all detected tissues, with the highest expression in the heart.Post LPS challenge, TfIL-15 increased rapidly to the maximum of 74 folds and 41 folds compared with that of the control group at 2 h post challenge (hpc) in the skin and blood. The induction of TfIL-15 mRNA in the spleen and liver was 3 folds and 18 folds at 12 hpc. Interestingly, at 96 hpc, the expression of TfIL-15 in the liver was up-regulated again to the 86 folds higher than that of the control group. These results indicate that TfIL-15 may play an important role in fish innate immune response against microbial infections. Furthermore, the mature peptide of TfIL-15 was expressed inBL21 (DE3) cells successfully, laying a foundation for further research on the function of TfIL-15 protein.

Roughskin sculpin ();Interleukin-15 (IL-15); Gene clone; Relative expression; Recombinant protein expression

ZHU Qian, E-mail: qianzhu@sdu.edu.com

* 山東省自然科學(xué)基金(ZR2016CP10)和威海市科技局項(xiàng)目(1070413421706)共同資助[This work was supported by Natural Science Foundation of Shandong Province(ZR2016CP10), and Weihai Science and Technology Bureau (1070413421706)]. 劉瑩瑩，E-mail: liuying0631@163.com

祝 茜，教授，E-mail: qianzhu@sdu.edu.com

2018-06-25,

2018-07-31

Q78; S917

A

2095-9869(2019)04-0095-09

10.19663/j.issn2095-9869.20180625001

劉瑩瑩, 于珊珊, 柴迎梅, 林嘯鵬, 祝茜. 松江鱸白介素15(TfIL-15)的結(jié)構(gòu)特征與重組表達(dá). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2019, 40(4): 95–103

Liu YY, Yu SS, Chai YM, Lin XP, Zhu Q. Characterization and recombinant protein expression of Interleukin-15 from roughskin sculpin,. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(4): 95–103

(編輯 馮小花)