武和英 王秀華 楊 冰 于黨輝 黃 倢

一對蝦養(yǎng)殖場的多病原跟蹤*

武和英1,2王秀華2,3①楊 冰2,3于黨輝2黃 倢2,3

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點實驗室 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

本研究通過對一對蝦養(yǎng)殖場定期采樣，采用分子生物學(xué)鑒定方法，分別對對蝦體內(nèi)及水環(huán)境中弧菌(sp.)、蝦肝腸胞蟲(, EHP)及主要病毒性病原進行了跟蹤檢測，同時，檢測了水環(huán)境中的氨氮及亞硝基氮含量的變化趨勢。結(jié)果顯示，該對蝦養(yǎng)殖場中存在的主要病原為多種致病弧菌和EHP，未檢測出對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)、偷死野田村病毒(CMNV)及傳染性皮下和造血組織壞死病毒(IHHNV)；該養(yǎng)殖場中弧菌檢出種類達到16種，其中，主要的弧菌種類有副溶血弧菌()溶藻弧菌 ()歐文氏弧菌()創(chuàng)傷弧菌()哈維氏弧菌()，且存在導(dǎo)致急性肝胰腺壞死病的副溶血弧菌(VPAHPND)；養(yǎng)殖中期大棚養(yǎng)殖池水體氨氮及亞硝氮濃度分別達到(3.5±2.0)、(8.2±0.7) mg/L，顯著高于室外養(yǎng)殖池水體氨氮及亞硝基氮濃度(<0.05)。養(yǎng)殖期跟蹤的7個蝦池中，出現(xiàn)嚴(yán)重對蝦病害的大棚養(yǎng)殖池比例達到100%，而室外養(yǎng)殖池僅出現(xiàn)輕度對蝦病害，發(fā)病池比例為25%。根據(jù)研究結(jié)果推測，造成大棚養(yǎng)殖池對蝦發(fā)病死亡的主要原因為養(yǎng)殖對蝦感染弧菌及蝦肝腸胞蟲，同時，養(yǎng)殖密度大、水體氨氮及亞硝基氮濃度過高等在對蝦病害發(fā)生中起到了協(xié)同作用。本研究結(jié)果可為當(dāng)前對蝦養(yǎng)殖病害防控技術(shù)提供理論支持和科學(xué)依據(jù)。

凡納濱對蝦；病原；弧菌；蝦肝腸胞蟲；病毒??；病原跟蹤

近年來，對蝦病害給國內(nèi)外對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，其特點表現(xiàn)為對蝦發(fā)病期提前(Tran, 2013)，病原種類繁多(韓琳等, 2018)，蝦病發(fā)生區(qū)域廣(Lightner, 2012; Nunan, 2014; Soto-Rodriguez, 2015; 王博雅等, 2017; 陳祿芝等, 2016)，且患病對蝦死亡率高(Han, 2015; Hernández-Palomares, 2018)。研究發(fā)現(xiàn)，目前中國對蝦養(yǎng)殖中主要存在的病毒性病原有白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV) (Hernández-Palomares, 2018)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)(Yan, 2016; 李秋璇等, 2015)、傳染性肌肉壞死病毒(Infectious myonecrosis virus，IMNV)(Kurcheti, 2017)及偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus, CMNV)(Zhang, 2017)，最新報道還存在對蝦黃頭病毒(Sinnuengnong, 2018; 朱羅羅等, 2016)、對蝦虹彩病毒(Qiu, 2017)；細菌性疾病主要為急性肝胰腺壞死綜合癥(Hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)(Han，2015；孫明玉等, 2018)和微孢子蟲病原蝦肝腸胞蟲(,EHP)導(dǎo)致的蝦肝腸胞蟲病(Prasertsri, 2009)。

在對蝦疾病防控方面，無論對蝦種苗場還是養(yǎng)殖場都已采取了防控措施，減少對蝦病原感染率、降低養(yǎng)殖水體中的病原數(shù)量，采用各種水質(zhì)改良劑、微生態(tài)制劑改善水質(zhì)，提高對蝦抗病力(Warneke, 2011; 王春迪等, 2016)，對蝦病害發(fā)生率依然沒有顯著下降(王筱珊等, 2017；陳祿芝等, 2016; 王博雅等, 2017; 施慧等, 2017)，且國內(nèi)對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量呈逐年下降趨勢。

為查明當(dāng)前對蝦養(yǎng)殖中病害形成的原因，本研究選擇山東濰坊沿海1個具備大棚養(yǎng)殖池、室外養(yǎng)殖池的凡納濱對蝦()養(yǎng)殖場作為蝦病調(diào)查研究的采樣點，采取定期取樣的方法，跟蹤監(jiān)測了對蝦及水體中的主要病原的種類數(shù)量，水中氨氮及亞硝基氮濃度的變化及對蝦病害發(fā)生情況，以期通過分析養(yǎng)殖場的對蝦疾病感染過程、發(fā)病特點，找出患病死亡的原因，為對蝦養(yǎng)殖的疾病防控提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖場基本資料收集

1.1.1 養(yǎng)殖場基本情況 對蝦養(yǎng)殖場位于山東省濰坊市北部近海的內(nèi)陸鹽堿地區(qū)域，養(yǎng)殖用水為近海河口區(qū)水源。養(yǎng)殖場現(xiàn)有水面13.8 hm2，其中，養(yǎng)殖用室外池塘30個(小型池塘12個，每個面積為0.2 hm2；中型池塘18個，每個面積為0.3 hm2)；大棚養(yǎng)蝦池4個(小型棚2個，每個0.1 hm2；大型棚 2個，每個0.5 hm2)。另有大型池塘6個，每個面積為0.8 hm2，用于水處理。室外養(yǎng)殖池平均有效水深為1.6 m，大棚養(yǎng)殖池平均有效水深為1.4 m。從其中隨機抽取池塘7個為跟蹤取樣蝦池，池塘編號、面積、放苗時間及密度等信息見表1。

表1 養(yǎng)殖池的基本情況

Tab.1 Basic information of the shrimp ponds

注：C1~C4：育苗場；G1~G3：大棚養(yǎng)殖池；W1~W4：室外養(yǎng)殖池

Note: C1~C4: Shrimp hatcheries; G1~G3: Indoor ponds; W1~W4: Outdoor ponds

1.1.2 養(yǎng)殖管理 養(yǎng)殖用水先經(jīng)漂白粉(30 mg/L)處理，再曝氣脫氯后使用，養(yǎng)殖期間，水體鹽度為11±3.6，pH為7.8~8.5，大棚養(yǎng)殖池水溫為26.2℃~ 32.5℃，室外養(yǎng)殖池水溫為23℃~28.5℃。大棚養(yǎng)殖池配備底部增氧管(3 W/m2)及水車式增氧機(1.5 W/m2)，室外養(yǎng)殖池配備水車式增氧機(1.5 W/m2)。在養(yǎng)殖期間，室外養(yǎng)殖池水體中的DO>5 mg/L，大棚養(yǎng)殖池水體DO>4 mg/L。養(yǎng)殖投喂人工配合餌料，蝦苗體長為3 cm以前，日投喂 6次，日投餌量為對蝦體重的5%；3 cm后，日投喂4次，日投餌量為對蝦體重的3%。大棚養(yǎng)殖池日換水量為(20±5)%，外塘養(yǎng)殖池每10 d換水1次，每次20%。

1.1.3 數(shù)據(jù)采集 自放苗開始，每20 d跟蹤檢測蝦池及進水渠的水質(zhì)指標(biāo)(溫度、鹽度、pH、DO、氨氮、亞硝氮)的變化情況，采集水樣、對蝦樣品進行細菌分離鑒定、病原檢測，并觀察記錄對蝦發(fā)病癥狀。

1.2 樣品采集及處理

1.2.1 水樣采集 用無菌瓶于換水前，在每個采樣池中取水樣100 ml，低溫帶回實驗室，用于氨氮及亞硝基氮分析。

1.2.2 細菌分離 從養(yǎng)殖場水源和養(yǎng)殖池水體中分別取100 μl的水樣，滅菌海水10倍梯度稀釋，無菌狀態(tài)下涂布2216E和TCBS固體培養(yǎng)基；無菌取對蝦腸道及肝胰腺混合研磨后，用生理鹽水10倍梯度稀釋，分別涂布2216E和TCBS的固體培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 病原檢測樣品采集 每個池塘每次取對蝦30尾，鰓絲、步足、肌肉及肝胰腺樣品合并為 1個獨立樣品，放入95%的乙醇中保存帶回實驗室，用TIANGEN試劑盒(TIANamp Marine Animals DNA Kit)提取樣品全基因組DNA，-80℃保存?zhèn)溆?；用RNAiso Plus (TaKaRa)提取樣品總RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 可培養(yǎng)細菌分析及弧菌的占有率

1.3.1 可培養(yǎng)細菌的分離鑒定 取接種培養(yǎng)后的2216E平板，根據(jù)細菌的形態(tài)、大小、顏色等進行分離純化。用細菌16S rDNA序列擴增方法對所分離的細菌進行初步鑒定(Bikrol,2010)，擴增產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司分析，所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對。

1.3.2 水體中可培養(yǎng)細菌數(shù)及總弧菌數(shù)評估 根據(jù)某水樣在一定稀釋度下涂布2216E平板形成的菌落數(shù)，推算該原始水樣每毫升中的總細菌數(shù)為單位水體中可培養(yǎng)細菌數(shù)；根據(jù)某水樣在一定稀釋度下涂布TCBS平板形成的菌落數(shù)，推算該原始水樣總弧菌數(shù)量，單位為CFU/ml。

1.3.3 某種弧菌占有率 根據(jù)TCBS平板所分離弧菌的菌落數(shù)、鑒定結(jié)果及樣品稀釋度，分別統(tǒng)計大棚養(yǎng)殖池和室外養(yǎng)殖池中各種弧菌(sp.)的數(shù)量?；【加新?單位水體中某種弧菌數(shù)量/單位水體中可培養(yǎng)細菌數(shù)×100%。

1.4 對蝦多病原檢測

EHP及AHPND的檢測方法分別參照J(rèn)aroenlak等(2016)和Dangtip等(2015)的方法；WSSV、IHHNV及IMNV的檢測采用國際獸疫局(Office Interna- tional des Epizooties, OIE 2016)推薦的檢測方法，CMNV檢測參照Zhang等(2014)的方法。其中，WSSV、IMNV及CMNV均為套式PCR，IHHNV采用常規(guī)PCR 2對物檢測。

1.5 水質(zhì)指標(biāo)檢測

使用YSI556便攜式水質(zhì)測定儀(Xylem, 美國)，每個取樣日的09:00測量養(yǎng)殖池水體溫度、鹽度、溶解氧和pH。水體中氨氮和亞硝基氮的濃度測定分別采用靛酚藍分光光度法(GB17378.4-2007)和萘乙二胺分光光度法(GB17378.4-2007)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD,=3)表示，運用SPSS 18.0軟件，經(jīng)單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan’s多重檢驗分析實驗結(jié)果的差異顯著性，設(shè)置差異水平=0.05 (<0.05為差異顯著)。

2 結(jié)果

2.1 對蝦生長及病害發(fā)生情況

觀察各采樣池塘中的對蝦發(fā)病情況，記錄發(fā)病時間，各蝦池病癥初次發(fā)生時間見表2。該養(yǎng)殖場大棚蝦池在發(fā)病前10 d已表現(xiàn)出攝食減少、生長緩慢的癥狀，之后陸續(xù)出現(xiàn)對蝦不攝食、空腸空胃、腸道細、趴邊，末期對蝦腹部和尾節(jié)變白，1周后出現(xiàn)死亡，且死亡率升高，最后出池；G2對蝦癥狀與死亡情況與G1完全相似，相應(yīng)的癥狀出現(xiàn)的時間僅較G1池晚4 d左右；G3的對蝦發(fā)病較為迅速，癥狀表現(xiàn)為對蝦不攝食，空腸空胃，發(fā)病1周后，對蝦死亡率近50%，消毒排塘。根據(jù)對蝦的發(fā)病特點及檢測結(jié)果，初步判定大棚養(yǎng)殖池中的對蝦發(fā)病為弧菌與蝦肝腸胞蟲混合感染所致，且與水體中氨氮、亞硝氮濃度過高有關(guān)；室外養(yǎng)殖池整個養(yǎng)殖周期發(fā)病較輕，個別池塘在養(yǎng)殖后期出現(xiàn)一定的發(fā)病癥狀，表現(xiàn)為對蝦趴邊，空腸空胃，但數(shù)量較少，跟蹤的4個室外養(yǎng)殖池中，僅W1在9月25日出現(xiàn)病癥，死亡率極低，因為已到收獲季節(jié)，采取了收蝦處理。

表2 各池對蝦發(fā)病情況

Tab.2 Occurrence of shrimp disease in different ponds

注：□/※：對蝦發(fā)病出現(xiàn)死亡，檢測確認(rèn)感染弧菌及腸胞蟲；–：對蝦正常；+?：對蝦發(fā)病但沒有檢測

Note: □/※: Shrimp infected by AHPND and EHP in the same time and appeared death; –: Shrimp is normal; +?: Dead shrimp appeared but without detection

2.2 整個檢測期養(yǎng)殖水體及對蝦體內(nèi)可培養(yǎng)細菌組成

整個檢測期間，共分離單菌落305個，對所分離的細菌進行初步鑒定，共成功鑒定細菌258株，其中，養(yǎng)殖水體中164株，對蝦體內(nèi)94株。比對結(jié)果顯示，養(yǎng)殖水體中164株菌中含有菌株49種，對蝦體內(nèi)有菌株31種，對蝦體內(nèi)和水體主要細菌組成見表3。由表3可知，養(yǎng)殖水體中菌群種類比對蝦體內(nèi)的種類多。

表3 對蝦體內(nèi)和養(yǎng)殖水體中的菌群組成

Tab.3 Component of predominant bacterial communities isolated from shrimp and water

續(xù)表3

2.3 不同養(yǎng)殖期大棚養(yǎng)殖池與室外養(yǎng)殖池中總弧菌密度

分別統(tǒng)計不同采樣時間所有跟蹤的大棚及室外養(yǎng)殖池中弧菌平均數(shù)量(圖1)。由圖1可知，經(jīng)過漂白粉處理后，再經(jīng)過脫氯曝氣的水，進入養(yǎng)殖池后其內(nèi)的弧菌數(shù)量在10 CFU/ml左右，隨著養(yǎng)殖時間的增長，無論室外養(yǎng)殖池還是大棚養(yǎng)殖池，水體中的弧菌數(shù)量都持續(xù)增多。且在各個采樣時間內(nèi)大棚養(yǎng)殖池中的弧菌數(shù)量均高于室外養(yǎng)殖池，至最后一次采樣(8月13日)，大棚養(yǎng)殖池中弧菌的平均密度達到了(3.7±0.9)′104CFU/ml；而室外養(yǎng)殖池僅為(6.3±4.0)′102CFU/ml。

圖1 大棚養(yǎng)殖池及室外養(yǎng)殖池中弧菌數(shù)量的變化趨勢

2.4 室外養(yǎng)殖池與大棚養(yǎng)殖池中不同采樣時間內(nèi)水體中主要弧菌種類占有率

分別統(tǒng)計大棚和室外養(yǎng)殖池養(yǎng)殖水體不同采樣時間各種弧菌的占有率(圖2和圖3)。由圖2和圖3可知，無論大棚養(yǎng)殖池還是室外養(yǎng)殖池，均存在副溶血弧菌溶藻弧菌歐文氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌。大棚養(yǎng)殖池中，各種弧菌于6月14日前的占有率變化不大，之后，水體中的副溶血弧菌占有率持續(xù)升高，至采樣末期達到了56.5%；室外養(yǎng)殖池養(yǎng)殖水體中7月4日之前，各種弧菌占有率均較低(13%以下)，隨后，副溶血弧菌的占有率快速上升，至采樣末期達21.4%。

圖2 不同采樣時間內(nèi)大棚養(yǎng)殖水體中5種主要弧菌的占有率

圖3 不同采樣時間內(nèi)外塘養(yǎng)殖水體中5種主要弧菌的占有率

2.5 EHP的檢測結(jié)果

所跟蹤的養(yǎng)殖池中，對蝦感染EHP的檢測結(jié)果見表4。由表4可知，養(yǎng)殖場于6月14日首次檢出EHP，出現(xiàn)在大棚養(yǎng)殖池G1，另外2個大棚養(yǎng)殖池分別于7月4日與24日檢出EHP。所有的4個外塘池僅在最后一次取樣時，有3個池中檢出EHP。代表性EHP檢測結(jié)果見圖4。

表4 EHP檢測結(jié)果

Tab.4 Detection results of EHP

注：G1~G3：大棚養(yǎng)殖池；W1~W4：室外養(yǎng)殖池； +：弱陽性；++：陽性；+++：強陽性；–：陰性；/：未放苗。下同

Note: G1~G3: Ponds indoor; W1~W4: Ponds outdoor; +: Weak positive; ++: Positive;+++: Strong positive; – : Negative; / : Not stocking. The same as below

圖4 7月4日各池樣品EHP PCR擴增產(chǎn)物

A：第1輪PCR產(chǎn)物；B：第2輪PCR產(chǎn)物；M：DL2000 DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；G1~G3：大棚養(yǎng)殖池；W1~W4：室外養(yǎng)殖池；N：陰性對照；P：陽性對照。下同

A: PCR products of first round; B: PCR products of second round; M: DL2000 DNA marker; G1~G3: Ponds indoor; W1~W4: Ponds outdoor; N: Negative control; P: Positive control. The same as below

2.6 AHPND檢測結(jié)果

AHPND跟蹤監(jiān)測的結(jié)果見表5。由表5可知，在7月4日檢測時，所有檢測池中的對蝦AHPND均為陰性，至7月24日，除了室外養(yǎng)殖池W4外，均檢出AHPND；8月13日檢測顯示，所用跟蹤的養(yǎng)殖池中的對蝦均有AHPND檢出。代表性AHPND檢測結(jié)果見圖5。

表5 AHPND檢測結(jié)果

Tab.5 Test results of AHPND

2.7 WSSV、IHHNV、CMNV、IMNV的檢測結(jié)果

對各采樣期對蝦樣品進行PCR擴增，檢測WSSV、IHHNV、CMNV、IMNV 4種對蝦病毒，均未有出現(xiàn)陽性條帶，部分代表性PCR結(jié)果分別見圖6。說明該養(yǎng)殖場養(yǎng)殖凡納濱對蝦感染這4種病原的幾率很低。

圖5 7月24日各池樣品AHPND PCR擴增產(chǎn)物

2.8 養(yǎng)殖水體中NH4+-N及NO2–-N的濃度變化

檢測各期大棚養(yǎng)殖池及室外養(yǎng)殖池水體中NH4+-N及NO2–-N平均濃度，結(jié)果分別見圖7、圖8。在大棚養(yǎng)殖池中，無論NH4+-N還是NO2–-N，其變化的幅度較大，而室外養(yǎng)殖池中，變化相對平穩(wěn)。NH4+-N的最高值出現(xiàn)在7月上旬的大棚養(yǎng)殖池中，平均濃度達到(3.5±2.0) mg/L，而NO2–-N濃度在養(yǎng)殖中后期的大棚養(yǎng)殖池中持續(xù)提高，至8月14日，平均濃度已達到(8.2±0.7) mg/ml。

3 討論

近幾年來，國內(nèi)外養(yǎng)殖的凡納濱對蝦病害發(fā)生較為普遍，導(dǎo)致養(yǎng)殖產(chǎn)量降低，效益下滑，而對蝦病原的多樣化給對蝦病害防控帶來了較大的難度。特別是EHP的暴發(fā)流行，給產(chǎn)業(yè)帶來的沖擊較大。EHP是一種細胞內(nèi)寄生蟲，首次發(fā)現(xiàn)于泰國(Tourtip, 2009)。近年來，在中國養(yǎng)殖的日本囊對蝦()、凡納濱對蝦以及羅氏沼蝦()中也有檢出(劉珍等, 2016)，對蝦感染EHP后可導(dǎo)致生長遲緩(Rajendran,, 2016; Chayaburakul,, 2004)。Aranguren等(2017)研究表明，對蝦感染EHP后，易受敏感性細菌的侵染。本研究結(jié)果表明，所跟蹤的養(yǎng)殖場，隨著養(yǎng)殖過程的持續(xù)，EHP病原存在擴散的可能，最初的EHP發(fā)現(xiàn)于大棚養(yǎng)殖池中，至養(yǎng)殖末期，除了W1外，其他所有跟蹤的池塘中均檢出EHP感染。盡管該養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖用水采用漂白粉消毒處理，但由于該養(yǎng)殖場進排水采用同一條水渠，對養(yǎng)殖廢水并沒有進行消毒處理，為病原擴散提供了條件。

圖6 8月13日各池樣品WSSV、IHHNV、CMNC及IMNV 4種對蝦病毒PCR擴增產(chǎn)物

A、B分別為WSSV第1輪及第2輪PCR產(chǎn)物；C、D分別為引物389F/389R及309F/309R檢測IHHNV PCR產(chǎn)物；E、F分別為CMNV第1輪及第2輪PCR產(chǎn)物，G、H分別為IMNV第1輪及第2輪PCR產(chǎn)物

A: First round PCR products for WSSV; B: Second round PCR products for WSSV; C: PCR products for IHHNV by primer 389F/389R; D: PCR products for IHHNV by primer309F/309R; E: First round PCR products for CMNV; F: Second round PCR products for CMNV; G: First round PCR products for IMNV, H: Second round PCR products for IMNV

圖7 對蝦養(yǎng)殖水體中NH4+-N濃度的變化趨勢

早期的研究發(fā)現(xiàn)，對蝦AHPND的發(fā)生與感染含有PirA及PirB質(zhì)粒的副溶血弧菌有關(guān)(Lee,, 2015; Tran,, 2013; 孫明玉等, 2018)，最近研究表明，對蝦感染坎氏弧菌(Han, 2017)、哈維氏弧菌(Kondo, 2015)后也表現(xiàn)出AHPND癥狀。本研究跟蹤檢測AHPND的結(jié)果顯示，在養(yǎng)殖前期(7月4日前)養(yǎng)殖場中并未檢測出該病菌，但在7月24日后，幾乎在所有跟蹤的養(yǎng)殖池中檢測到了AHPND的弱陽性信號，且持續(xù)到末期感染均為弱陽性，結(jié)合養(yǎng)殖對蝦發(fā)病特點及其他弧菌的檢測結(jié)果認(rèn)為，該養(yǎng)殖場中對蝦存在誘發(fā)AHPND的副溶血弧菌，特別是在大棚養(yǎng)殖池中，但副溶血弧菌并不是唯一導(dǎo)致對蝦發(fā)病的因素，因在養(yǎng)殖水體中及對蝦體內(nèi)也檢測出其他的致病弧菌，如溶藻弧菌、歐文氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和哈維氏弧菌，對該類弧菌的致病力評估尚待研究。

圖8 對蝦養(yǎng)殖水體中NO2--N濃度的變化趨勢

在跟蹤的7個養(yǎng)殖池中，出現(xiàn)明顯病害的3個池塘均為大棚養(yǎng)殖池，盡管所放的對蝦種苗來源及養(yǎng)殖用水與室外養(yǎng)殖池相似，因大棚養(yǎng)殖池投苗密度是室外養(yǎng)殖池的5倍，相應(yīng)的餌料投喂量也遠高于室外養(yǎng)殖池，由此可導(dǎo)致水體中氨氮及亞硝基氮的濃度在養(yǎng)殖中后期出現(xiàn)超標(biāo)現(xiàn)象(圖4、圖5)，達到了危害對蝦的范圍(魏俊利等, 2012)。表明，大棚養(yǎng)殖池中水質(zhì)管理存在欠缺，導(dǎo)致養(yǎng)殖廢物排放不徹底，水質(zhì)變差。已有研究表明，較高的氨氮濃度能降低凡納濱對蝦的抵抗力(黃翔鵠等, 2006)，增加對副溶血弧菌的易感性(葛紅星等, 2014)。

綜合分析本研究所檢測的各種對蝦病原及養(yǎng)殖環(huán)境條件認(rèn)為，該凡納濱對蝦養(yǎng)殖場存在多種對蝦病原，其中，多種弧菌與EHP共感染是導(dǎo)致大棚養(yǎng)殖對蝦發(fā)病的原因之一。結(jié)合大棚養(yǎng)殖池與室外養(yǎng)殖池的發(fā)病特點，可以推斷，大棚養(yǎng)殖池中因放養(yǎng)密度高，水質(zhì)管理不善，氨氮及亞硝基氮濃度過高，是導(dǎo)致大棚養(yǎng)殖池對蝦發(fā)病的主要因素。本研究跟蹤調(diào)查的WSSV、IHHNV、IMNV、CMNV 4種對蝦病毒，是近年來在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中危害較為嚴(yán)重的病原，但是，在本場并沒有陽性樣品檢出，表明這些病毒性病原不是該對蝦養(yǎng)殖場的致病因子。提示在未來的對蝦養(yǎng)殖中，對EHP、細菌病的防控及水環(huán)境管理也應(yīng)引起高度的重視。

Aranguren LF, Han JE, Tang KFJ,.(EHP) is a risk factor for acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) and septic hepatopancreatic necrosis (SHPN) in the Pacific white shrimp. Aquaculture, 2017, 471: 37–42

Bikrol A, Saxena N, Singh K. Characterization ofstrains isolated from different varieties of soybean with 16SrDNA RFLP from agricultural land of Madhya Pradesh, India. Indian Journal of Microbiology, 2010, 50(4): 404–411

Chayaburakul K, Nash G, Pratanpipat P,. Multiple pathogens found in growth-retarded black tiger shrimpcultivated in Thailand. Diseases of Aquatic Organisms, 2004, 60(2): 89–96

Chen LZ, Yu XY, Hu YC,. Preliminary investigation of Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) fromin west Guangdong Province. Journal of Fisheries Research, 2016, 38(4): 273–280 [陳祿芝, 余霞艷, 胡一丞, 等. 粵西地區(qū)凡納濱對蝦蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒感染情況的初步調(diào)查. 漁業(yè)研究, 2016, 38(4): 273–280]

Dangtip S, Sirikharin R, Sanguanrut P,. AP4 method for two-tube nested PCR detection of AHPND isolates of. Aquaculture Reports, 2015, 2: 158–162

Ge HX, Li J, Chen P. The Immune Response ofand its susceptibility tounder stress caused by ammonia nitrogen at different concentrations. Progress in Fishery Sciences, 2014, 35(6): 76–82 [葛紅星, 李健, 陳萍, 等. 氨氮脅迫下凡納濱對蝦對副溶血弧菌的易感性. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2014, 35(6): 76–82]

Han JE, Tang KF, Aranguren LF,. Characterization and pathogenicity of acute hepatopancreatic necrosis disease natural mutants,ABvp(?), andABvp(+)strains. Aquaculture, 2017, 470: 84–90

Han JE, Tang KFJ, Pantoja CR,qPCR assay for detecting and quantifying a virulence plasmid in acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) due to pathogenic. Aquaculture, 2015, 442: 12–15

Han L, Wang XH, Yang B,. Analysis of pathogen in an outbreak death of. Journal of Fisheries of China, 2018, 42(3): 431–441 [韓琳, 王秀華, 楊冰, 等. 一例日本囊對蝦暴發(fā)性死亡的病原分析. 水產(chǎn)學(xué)報, 2018, 42(3): 431–441]

Hernández-Palomares MLE, Godoy-Lugo JA, Gómez-Jiménez S,. Regulation of lactate dehydrogenase in response to WSSV infection in the shrimp. Fish and Shellfish Immunology, 2018, 74: 401–409

Huang XH, Li CL, Deng L. The toxicity of NO2-N onand effects of NO2-N on factors relating to the anti-disease ability. Acta Hydrobiologica Sinica, 2006, 30(4): 466–471 [黃翔鵠, 李長玲, 鄭蓮, 等. 亞硝酸鹽氮對凡納濱對蝦毒性和抗病相關(guān)因子影響. 水生生物學(xué)報. 2006, 30(4): 466–471]

Jaroenlak P, Sanguanrut P, Williams BA,. A nested PCR assay to avoid false positive detection of the microsporidian(EHP) in environmental samples in shrimp farms. PLoS ONE, 2016, 11(11): e0166320

Kondo H, Van PT, Dang LT,. Draft genome sequence of non-acute hepatopancreatic necrosis disease strain KC13.17.5, isolated from diseased shrimp in Vietnam. Genome Announcement, 2015, 3(5): e00978-15

Kurcheti PP, Shyam KU, Banu H,. Infectious myonecrosis virus (IMNV)–An alarming viral pathogen to Penaeid shrimps. Aquaculture. 2017, 477: 99–105

Lee CT, Chen IT, Yang YT,. The opportunistic marine pathogenbecomes virulent by acquiring a plasmid that expresses a deadly toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, 112(34): 10798–10803

Li QX, Fei RM. The prokaryotic expression for ORF3 gene of infections hypodermal and hematopoietic necrosis virus NJ strain and its bioinformatics analysis. Journal of Fisheries of China, 2015, 39(3): 439–446 [李秋璇, 費榮梅. 傳染性皮下及造血組織壞死病毒NJ株ORF3基因的原核表達及生物信息學(xué)分析. 水產(chǎn)學(xué)報, 2015, 39(3): 439–446]

Lightner DV, Redman RM, Pantoja CR,. Early mortality syndrome affects shrimp in Asia. Global Aquaculture Advocate, 2012, 15(1): 40

Liu Z, Zhang QL, Wan XY,. Development of real-time PCR assay for detecting microsporidianand the application in shrimp samples with different growth rates. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(2): 119–126 [劉珍, 張慶利, 萬曉媛, 等. 蝦肝腸胞蟲()實時熒光定量PCR檢測方法的建立及對蝦樣品的檢測. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2016, 37(2): 119–126]

Nunan L, Lightner D, Pantoja C,. Detection of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in Mexico. Diseases of Aquatic Organisms, 2014, 111(1): 81–86

Prasertsri S, Limsuwan C, Chuchird N. The effects of microsporidian () infection on the growth and histopathological changes in pondreared Pacific white shrimp (). Kasetsart Journal-Natural Science, 2009, 43: 680–668

Qiu L, Chen MM, Wan XY,. Characterization of a new member of, shrimp hemocyte iridescent virus (SHIV), found in white leg shrimp (). Scientific Reports, 2017, 7(1): 11834

Rajendran KV, Shivam S, Praveena EP,. Emergence of(EHP) in farmed()in India. Aquaculture, 2016, 454: 272–280

Shi H, Xu WJ, Xie JJ,. Pathogenicity ofslow growth syndrome in intensively cultured penaeid shrimp in Zhoushan. Journal of Fishery Sciences of China, 2017, 24(2): 387–394 [施慧, 許文軍, 謝建軍, 等. 舟山地區(qū)大棚凡納濱對蝦生長緩慢病因的調(diào)查分析. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2017, 24(2): 387–394]

Sinnuengnong R, Attasart P, Smith DR,. Administration of co-expresseddensovirus-like particles and dsRNA-YHV-Pro provide protection against yellow head virus in shrimp. Journal of Biotechnology, 2018, 267: 63–70

Soto-Rodriguez SA, Gomez-Gil B, Lozano-Olvera R,. Field and experimental evidence ofas the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease of cultured shrimp () in Northwestern Mexico. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(5): 1689–1699

Sun MY, Feng B, Zhang ZH,. New sequence type isolates of AHPND-causingfromby multilocus sequence typing. Journal of Fisheries of China, 2018, 42(3) 410–418 [孫明玉, 馮博, 張昭寰, 等. 引起凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病的副溶血弧菌MLST新序列型. 水產(chǎn)學(xué)報, 2018, 42(3): 410–418]

Tourtip S, Wongtripop S, Stentiford GD,.sp. nov. (Microsporida: Enterocytozoonidae), a parasite of the black tiger shrimp(Decapoda: Penaeidae): Fine structure and phylogenetic relationships. Journal of Invertebrate Pathology, 2009, 102(1): 21–29

Tran L, Nunan L, Redman RM,. Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Diseases of Aquatic Organisms, 2013, 105(1): 45–55

Wang BY, Wang L, Liu MR,. Epidemiological investigation of three major viruses and(EHP) in Pacific white leg shrimpin Liaoning Province. Journal of Dalian Fisheries University, 2017, 32(2): 150–154 [王博雅, 王力, 劉美如, 等. 凡納濱對蝦3種主要病毒和蝦肝腸胞蟲在遼寧地區(qū)的流行情況分析. 大連海洋大學(xué)學(xué)報, 2017, 32(2): 150–154]

Wang CD, Song XL, Zhang XJ,. Effects of addingPC465 to rearing water on disease resistance of. Journal of Fishery Sciences of China, 2016, 23(1): 146–155 [王春迪, 宋曉玲, 張曉靜, 等. 養(yǎng)殖水體中添加蠟樣芽孢桿菌PC465對凡納濱對蝦抗病力的影響. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2016, 23(1): 146–155]

Wang XS, Hu ZB, Fei RM. Prevalence of three viruses in Pacific white leg shrimp in Jiangsu Province and the analysis of coding sequence of five strains of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus. Journal of Fisheries of China, 2017, 41(10): 1623–1630 [王筱珊, 胡智博, 費榮梅. 江蘇地區(qū)對蝦3種病毒病的流行病學(xué)調(diào)查及5株IHHNV的編碼區(qū)基因序列分析. 水產(chǎn)學(xué)報, 2017, 41(10): 1623–1630]

Warneke S, Schipper LA, Bruesewitz DA,. Rates, controls and potential adverse effects of nitrate removal in a denitrification bed. Ecological Engineering, 2011, 37(3): 511–522

Wei JL, Sun JS, Li X,Acute toxic effects of ammonia nitrogen on. Journal of Tianjin Agricultural University, 2012, 19(3): 58–61 [魏俊利, 孫金生, 李翔, 等. 氨氮對凡納濱對蝦稚蝦的急性毒性作用. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報, 2012, 19(3): 58–61]

World Organization for Animal Health (OIE). Manual of diagnostic tests for aquatic animals 2016. Paris, French: World Organization for Animal Health, 2010, 110–186

Yan DC, Huang J, Yang B,. Competition of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) with white spot syndrome virus (WSSV) for binding to shrimp cellular membrane. Journal of Fish Diseases, 2016, 39(10): 1225–1229

Zhang QL, Liu Q, Liu S,. A new nodavirus is associated with covert mortality disease of shrimp. Journal of General Virology, 2014, 95(12): 2700–2709

Zhang QL, Xu TT, Wan XY,. Prevalence and distribution of covert mortality nodavirus (CMNV) in cultured crustacean. Virus Research, 2017, 233: 113–119

Zhu LL, Zhang QL, Wan XY,. Molecular epidemiology of a new yellow head virus strain in China. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(3): 68–77 [朱羅羅, 張慶利, 萬曉媛, 等. 我國一株新型黃頭病毒的分子流行病學(xué). 漁業(yè)科學(xué)進展, 2016, 37(3): 68–77]

Tracking of Shrimp Multiple Pathogens in a Shrimp Farm

WU Heying1,2, WANG Xiuhua2,3①, YANG Bing2,3, YU Danghui2, HUANG Jie2,3

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity, Qingdao 266071; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

In order to clarify the shrimp disease occurred currently in the shrimp farms, shrimp pathogens including vibrio,(EHP) and four viral pathogens(WSSV、IMNV、CMNV and IHHNV) were detected using molecular biological detect methods under a regular sampling pattern, meanwhile the concentration of ammonia nitrogen and nitrogenous nitrogen in water body were also detected. The results showed that the main pathogens in the shrimp farm comprised various pathogenic vibrio and EHP. However the shrimp virus WSSV、IMNV、CMNV and IHHNV were not detected. The vibrio species isolated and identified reached 16 totally, and the main species were,,,. Furthermore thethat could cause acute hepatopancreatic necrosis disease (VAHPND) was found out. The concentration of ammonia nitrogen and nitrate nitrogen in the indoor pond reaching (3.5±2.0) mg/L and (8.2±0.7) mg/L, were significantly higher than that in the outdoor pond respectively (< 0.05) in the medium-term (July 24) of crop cycle. The intensity of infection of VAHPNDand EHP show a growing trend in the culture period. In the seven ponds monitored, the ponds indoor had a higher incidence rate (100%), while the ponds outdoor had a lower incidence rate (25%). The results indicated that shrimp disease onset in the pond indoor might be caused by the infection of various vibrio and EHP, also the higher stocking density, higher concentration of the ammonia nitrogen and nitrate nitrogen in the water body played a synergy role in outbreak of shrimp disease. The results of this study could provide theoretical support and scientific data for the prevention and control of shrimp diseases.

; Pathogen;;(EHP); Viral pathogens; Pathogen tracking

WANG Xiuhua, E-mail: wangxh@ysfri.ac.cn

S945.1

A

2095-9869(2019)04-0104-11

10.19663/j.issn2095-9869.20180518002

* 廣西創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展專項(桂科AA17204044)和中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(20603022018001)共同資助[This work was supported by Guangxi Innovation-Driven Development Project (AA17204044), and Central Public- Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS(20603022018001)]. 武和英，E-mail: 1450847915@qq.com

王秀華，研究員，E-mail: wangxh@ysfri.ac.cn

2018-05-18,

2018-05-30

武和英, 王秀華, 楊冰, 于黨輝, 黃倢. 一對蝦養(yǎng)殖場的多病原跟蹤. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2019, 40(4): 104–114

Wu HY, Wang XH, Yang B, Yu DH, Huang J. Tracking of shrimp multiple pathogens in a shrimp farm. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(4): 104–114

(編輯 馬璀艷)