陳宇凌，陳銀元，劉安倩，李文，李同祥，王陶

(江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實驗室(徐州工程學(xué)院)，江蘇 徐州，221018)

近年來，重金屬污染引起的食品安全問題已成為人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)[1-2]。在所有重金屬污染問題中，鎘因其生物毒性大、移動性強(qiáng)成為最受關(guān)注的對象之一[3]。鎘是一種蓄積性十分強(qiáng)的重金屬元素，即便處于很低的濃度，一旦蓄積起來，會對人體和其他生物造成危害[4]。鎘雖然在通常情況下含量低，但還可以通過食物鏈來富集而達(dá)到高濃度。食品中鎘的存在形態(tài)主要與蛋白質(zhì)、脂類和多糖等形成螯合配體[5-7]。由于環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和食品加工問題等，常常會引起食品中鎘的污染。因此，對食物中鎘的去除和吸附研究就至關(guān)重要。

傳統(tǒng)處理重金屬的方法有很多，如膜分離法、電解法、沉淀法等，但這些方法也呈現(xiàn)出成本高、技術(shù)要求高、釋放副產(chǎn)物、對環(huán)境造成二次污染等問題[8-9]。近年來，生物吸附法引起了人們的高度重視，生物吸附法具有高效、廉價的優(yōu)點(diǎn)。生物吸附是指利用生物材料去除重金屬，利用吸附劑與金屬離子發(fā)生物理或化學(xué)反應(yīng)，而生物材料劃分為微生物材料、植物材料和動物材料[10-11]。其中，微生物具有繁殖快、代謝旺、易培養(yǎng)、成本低的優(yōu)勢，因此，其在重金屬吸附中具有獨(dú)特地位[12-13]。乳酸菌作為食品安全級別的益生菌，能夠通過離子交換、物理吸附、胞內(nèi)擴(kuò)散等方式吸附鎘[14]，是很好的鎘污染防治菌株?？蓪⑵渥鳛殒k的吸附劑添加到鎘污染的食品中去，移除食品中的鎘[15-18]；或者作為膳食補(bǔ)充劑攝入到體內(nèi)，使其在腸道內(nèi)吸附鎘，再通過糞便將鎘排出體外[19-20]，防止鎘在體內(nèi)積累。KINOSHITA等[21]從牛腸、豬腸、日式泡菜、日本甘酒、韓國泡菜和酸奶中分離出了包括乳酸桿菌、鏈球菌、腸球菌等103株乳酸菌，并對其進(jìn)行了吸附研究，發(fā)現(xiàn)大部分乳酸菌都具有良好鎘吸附能力。目前，雖有篩選得到能耐受一定鎘濃度的乳酸菌株，但這些菌株仍存在耐鎘和/或吸附鎘的能力不強(qiáng)，遺傳穩(wěn)定性不高，菌體生長及吸附條件窄等諸多不足，高耐鎘乳酸菌種資源的挖掘工作還有待于進(jìn)一步進(jìn)行。

因此，本研究擬從四川自制泡菜汁中篩選出乳酸菌，通過含不同濃度的鎘培養(yǎng)基馴化乳酸菌，從而得到耐鎘最高的菌株，對此菌株進(jìn)行初步鑒定，并進(jìn)一步研究其吸附鎘及其他重金屬的性能，為乳酸菌株治理食品中重金屬鎘及其他重金屬污染奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川萬源自釀泡菜汁；CdCl2·2H2O、MnSO4、CuSO4·5H2O、吐溫-80(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PbSO4(分析純)，阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；酸度計，上海市羲精密儀器有限公司；生物顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；A3AFG-13原子吸收分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 MRS培養(yǎng)基

(1)MRS液體培養(yǎng)基配制方法(g/L)：葡萄糖20.0、牛肉浸膏 15.0、酵母浸膏5.0、蛋白胨10.0、無水乙酸鈉5.0、檸檬酸氫二銨2.0、KH2PO42.62、MnSO4·4H2O 0.198、MgSO4·7H2O 0.58、吐溫-80 1.0 mL，無菌水1 000 mL，pH 6.0～6.5，121 ℃蒸汽滅菌20 min。

(2)MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入20 g/L的瓊脂粉。

1.3.2 高鎘培養(yǎng)基

在MRS固體/液體培養(yǎng)基中按所需濃度加入相應(yīng)CdCl2·2H2O。

1.4 耐鎘乳酸菌株的富集、篩選及耐鎘能力

1.4.1 乳酸菌株的初篩

將四川自釀食用泡菜汁原液，稀釋成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，將10-4，10-5，10-6泡菜稀釋液取100 μL至已凝固好的含Cd2+質(zhì)量濃度為50 mg/L 的MRS固體培養(yǎng)基上，用滅過菌的涂布棒將稀釋液反復(fù)涂布至均勻，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d。

1.4.2 乳酸菌株的復(fù)篩

將初篩出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶試驗，復(fù)篩出接觸酶試驗陰性，革蘭氏陽性菌株，作為下一步耐鎘馴化的菌株。

1.4.3 高耐鎘乳酸菌株的富集、篩選與遺傳穩(wěn)定性

將復(fù)篩出的菌株分別轉(zhuǎn)移接種到Cd2+質(zhì)量濃度更高的250、400、500、1 300、2 000、4 000、6 000、10 000、11 000 mg/L 的固體培養(yǎng)基和100、300、500、600、800、900、1 000 mg/L的液體培養(yǎng)基中，觀察其生長狀況，每個質(zhì)量濃度設(shè)置3個平行，對篩選出的高耐隔菌株分別在最高耐受濃度的固體和液體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10代，觀察其生長和耐隔情況。

1.5 耐鎘乳酸菌的鑒定

1.5.1 菌落形態(tài)觀察及生理生化鑒定

將活化后的高耐鎘菌株接種到MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d后，觀察其菌落大小、顏色、組織狀態(tài)及邊緣特征，生理生化的鑒定參考標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[22]。

1.5.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

1.5.2.1 菌株 16S rDNA的PCR擴(kuò)增和序列測定

按細(xì)菌基因組提取試劑盒說明，提取出目標(biāo)菌株的基因組DNA。

根據(jù)細(xì)菌16S rDNA序列保守性設(shè)計通用引物[23]：

上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

下游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′

反應(yīng)體系 40 μL：DNA模板6 μL；上游引物 1 μL； 下游引物 1 μL；ddH2O 12 μL；2×Taq PCR Master Mix 20 μL；

PCR循環(huán)條件：96 ℃預(yù)變性4 min；96 ℃變性30 s； 55 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min；30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。

1.5.2.2 序列比對與進(jìn)化樹構(gòu)建

用經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，送到生工(上海)生物工程股份有限公司測序，在序列庫提交所測得的序列，用BLAST對比細(xì)菌的16S rDNA基因序列；將菌ZY-6測序后所得序列與GenBank中相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列，用Clustal X進(jìn)行比對，在MEGA3.1 中采用Neighbor-Joining(鄰位發(fā)生法) 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析鑒定此菌株與模式菌株的同源性[24]。

1.6 耐鎘乳酸菌的鎘吸附特性

菌株ZY-6接種于MRS培養(yǎng)基活化18 h后，于8 000 r/min離心20 min，收集菌體，超純水洗滌2次后，將濕菌體懸浮于鎘離子質(zhì)量濃度分別為50、100、200、300、500、700、900 mg/L的水溶液中，使菌體終質(zhì)量濃度為5 g/L，于 37 ℃吸附2 h，8 000 r/min離心20 min，采用原子吸收分光光度計火焰法分別測定吸附前后上清液中的Cd2+濃度，代入公式(1)計算吸附率(A)。

(1)

式中：ρ0、ρ1分別為上清中Cd2+的初始和吸附后的質(zhì)量濃度，mg/L。

1.7 耐鎘乳酸菌對其他重金屬的吸附性能

將活化洗滌后的ZY-6濕菌體分別懸浮于100 mg/L 的含Pb2+、Cu2+、Mn2+的水溶液中，使?jié)窬w終質(zhì)量濃度為5 g/L，于 37 ℃吸附2 h，8 000 r/min離心20 min，采用原子吸收分光光度計火焰法分別測定吸附前后上清液中的重金屬濃度，計算吸附率。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

將梯度稀釋后的四川自制泡菜汁涂布于Cd2+質(zhì)量濃度為50 mg/L的MRS固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)2～3 d后，結(jié)果見圖1，由圖1可知，有大量乳酸菌類似菌落長出，選取128株長勢較好的單菌落進(jìn)行劃線分離和馴化，直至得到純的單菌落。對這128個菌株進(jìn)行革蘭氏染色和接觸酶試驗，篩選出革蘭氏染色陽性、接觸酶試驗陰性的疑似乳酸菌7株。

圖1 初篩菌株單菌落Fig.1 Single colony of stains by primary screening

2.2 高耐鎘乳酸菌的富集、篩選及遺傳穩(wěn)定性

2.2.1 固體耐鎘結(jié)果及遺傳穩(wěn)定性

挑取7株疑似乳酸菌單菌落在MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，并不斷提升培養(yǎng)基中的鎘濃度，對菌株進(jìn)行馴化，結(jié)果見表1。由表1可以看出，隨著Cd2+濃度的不斷提升，7株菌的生長受到不同程度的抑制，Cd2+質(zhì)量濃度為400 mg/L時，菌株ZY-4停止生長；500 mg/L時，菌株ZY-2、ZY-5、ZY-7停止生長；1 300 mg/L時， 菌株ZY-1停止生長；4 000 mg/L時，菌株ZY-3停止生長；11 000 mg/L時，菌株ZY-6停止生長。圖2顯示當(dāng)離子質(zhì)量濃度從250 mg/L上升到10 000 mg/L過程中，菌株ZY-6在平板上的菌落數(shù)在逐漸變少。將菌株ZY-6連續(xù)傳代培養(yǎng)10次后，其仍可在含10 000 mg/L的鎘培養(yǎng)基上生長，具有一定的遺傳穩(wěn)定性。

表1 七株菌株在固體高鎘培養(yǎng)基上的生長情況Table 1 The Growth of seven cadmium tolerant strains in solid medium containing high concentrations of Cd2+

注：“+++”表示生長旺盛；“++”表示生長情況一般；“+”表示菌株微生長；“-”表示菌株不生長。

A～I(xiàn)-Cd2+質(zhì)量濃度分別為250、400、500、1 300、2 000、4 000、6 000、9 000、10 000 mg/L圖2 ZY-6在不同Cd2+質(zhì)量濃度平板中的生長情況Fig.2 The Growth of ZY-6 in solid medium containing different concentrations of Cd2+

綜上，菌株ZY-6固體耐鎘性能最好，在固體培養(yǎng)基中可以耐受10 000 mg/L的鎘，高于目前報道的菌株在高鎘平板上的耐隔性能。

2.2.2 液體耐鎘結(jié)果及遺傳穩(wěn)定性

將7株菌接種于高鎘液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并不斷提升鎘濃度，測定OD600以判斷菌株的生長情況，結(jié)果見表2?？梢钥闯觯S著鎘濃度的不斷提升，菌的生長受到了不同程度的抑制，鎘離子質(zhì)量濃度為500 mg/L時，菌株ZY-1、ZY-2、ZY-4、ZY-5、ZY-7停止生長；900 mg/L時，菌株ZY-3停止生長；1 000 mg/L時，菌株ZY-6停止生長。相比較其他菌株，菌株ZY-6的液體耐鎘性能最好，可以耐受900 mg/L的鎘。傳代培養(yǎng)10次后，其仍可在含900 mg/L的鎘液體培養(yǎng)基上生長，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)合固體耐受實驗結(jié)果，最終選擇菌株ZY-6進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 耐鎘乳酸菌ZY-6的鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)

菌株ZY-6的菌落形態(tài)如圖3。由圖3可知，菌株ZY-6在MRS固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不透明的小菌落，乳白色，表面光滑，呈微隆起圓狀輪廓，直徑1～2 mm， 較濕潤，易挑取。

表2 七株菌株在高鎘液體培養(yǎng)基中的生長情況Table 2 The Growth of seven cadmium tolerant strains in liquid medium containing high concentrations of Cd2+

注：表內(nèi)結(jié)果為OD600值；“-”表示不生長。

圖3 ZY-6菌落形態(tài)圖Fig.3 Colonies of ZY-6

2.3.2 顯微形態(tài)

將菌株ZY-6 37 ℃培養(yǎng)2 d，形成明顯菌落后，取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如圖4所示。菌株ZY-6染色后呈現(xiàn)紫色，為革蘭氏陽性菌，菌體呈現(xiàn)不規(guī)則的短桿狀，兩端鈍圓，無鞭毛，無芽孢。

圖4 ZY-6顯微形態(tài)圖(×1 000)Fig.4 Morphology of single cell obeserved by microscope

2.3.3 生化試驗結(jié)果

甲基紅實驗結(jié)果呈陽性；H2O2、乙醇氧化乙酸、淀粉水解、葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、V-P實驗、吲哚實驗、硫化氫實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化、菌體運(yùn)動實驗結(jié)果均呈陰性。

2.3.4 生理試驗結(jié)果

2.3.4.1 初始pH對菌株生長的影響

菌株接種于不同初始pH的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后測定OD600，結(jié)果如圖5。ZY-6生長較適的pH范圍較寬(pH=5～8)，最適pH值為7。當(dāng)pH<3或>11時，菌株ZY-6生長受到抑制。

圖5 初始pH對菌株ZY-6生長情況的影響Fig.5 The effect of pH on growth of ZY-6

2.3.4.2 耐鹽性實驗

將菌株接種于不同NaCl質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后測定OD600，結(jié)果如圖6所示。菌株在NaCl質(zhì)量濃度為0～30 g/L時，生長得較好，最佳生長NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L時，最大耐受NaCl質(zhì)量濃度為50 g/L， 具有一定的耐鹽性。

圖6 NaCl質(zhì)量濃度對菌ZY-6生長情況的影響Fig.6 The effect of concentration of NaCl on growth of ZY-6

2.3.4.3 溫度對菌株生長的影響

將菌株接種于培養(yǎng)基中，置于不同溫度下培養(yǎng)后測定OD600，結(jié)果見圖7?？梢钥闯鼍闦Y-6在20～42 ℃ 生長較好，最適生長溫度為37 ℃。

圖7 生長溫度對菌株ZY-6生長情況的影響Fig.7 The effect of temperature on growth of ZY-6

2.3.5 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.5.1 16S rDNA的電泳圖

以ZY-6基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增其16S rDNA， 以1%的瓊脂糖電泳，并將產(chǎn)物與Marker對比，結(jié)果見圖8。由圖8可見，菌株ZY-6在1 500 bp左右處出現(xiàn)清晰條帶，表明菌株ZY-6的16S rDNA序列大小約為1 500 bp。

圖8 16S rDNA電泳結(jié)果圖Fig.8 The electrophoresis analysis of 16S rDNA

2.3.5.2 進(jìn)化樹結(jié)果

將菌株ZY-6的PCR產(chǎn)物電泳條帶切割回收，并對其進(jìn)行測序，序列長度為1 523 bp，序列提交至Gene Bank，獲得其登錄號為MK417560，將此序列與Gene Bank中已發(fā)表的 16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對，構(gòu)建以菌株ZY-6和其相關(guān)模式菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖9所示。菌株ZY-6和WeissellaviridescensNRIC 1536 AB023236 100.0處于一個分支，同源性為100%，因此，結(jié)合形態(tài)鑒定、生理生化試驗，確定此菌株為綠色魏斯菌(Weissellaviridescens)。

圖9 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic dendrogram

2.4 菌株ZY-6對鎘的吸附作用

檢測綠色魏斯菌ZY-6對不同Cd2+質(zhì)量濃度的吸附作用，結(jié)果見圖10。可以看出，菌體對于50～900 mg/L的Cd2+都呈現(xiàn)出了一定的吸附作用，隨Cd2+濃度的增大，吸附率逐漸降低，表明菌體對鎘的吸附能力有限，濃度過高會對菌體造成不良影響，從而影響菌體對鎘的吸附能力，菌體對50 mg/L的Cd2+吸附效果最好，吸附率達(dá)61.78%。

圖10 ZY-6在不同質(zhì)量濃度鎘溶液中的吸附率Fig.10 The adsorption rate of ZY-6 in solution containing different concentrations of Cd2+

2.5 菌株ZY-6對其他重金屬的吸附作用

檢測菌株ZY-6對另外3種重金屬鉛、銅、錳的吸附作用，結(jié)果見圖11，可以看出，菌株ZY-6對這3種重金屬都顯示出了一定的吸附效果，對鉛和銅的吸附率較高，分別為83.65%和71.31%，對錳的吸附率較低，為18.16%。菌體對于不同的金屬顯示出不同的吸附能力可能和該菌株對不同重金屬的抗性機(jī)制不同有關(guān)[25]。

圖11 菌株ZY-6對Pb2+、Cu2+、Mn2+的吸附作用Fig.11 Adsorption of Pb2+, Cu2+, Mn2+by ZY-6

3 結(jié)論

本研究從四川自制泡菜汁中篩選出高耐鎘乳酸菌株ZY-6，其在液體和固體MRS培養(yǎng)基中耐鎘質(zhì)量濃度分別為900 mg/L和10 000 mg/L，其固體耐鎘性能高于目前報道的菌株，具備較好的應(yīng)用潛力；其濕菌體對50 mg/L Cd2+的吸附率為61.34%，對100 mg/L Cd2+的吸附率為39.84%，高于邵鑫等篩選的高耐鎘乳酸菌株LAB-5的吸附率31.40%[14]。同時該菌株對多種重金屬如鉛、銅、錳顯示出一定的吸附能力，對鉛的吸附率高達(dá)83.65%。在篩選高吸附性能的菌株時將篩選標(biāo)準(zhǔn)定為當(dāng)吸附率高于18%則認(rèn)為該菌株具有高吸附性能[26]，因此，菌株ZY-6被認(rèn)為是高吸附菌株，可為復(fù)合污染的生物修復(fù)提供良好的菌株材料。

經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，該菌株屬于綠色魏斯菌(Weissellaviridescens)，目前鮮見綠色維斯菌作為鎘吸附劑的報道，從生長特性上看來，該菌株能在較寬的溫度范圍及pH范圍內(nèi)生長，有較好的耐鹽性，有利于其實際利用。該菌株的獲得在一定程度上豐富了耐鎘菌株資源，下一步可優(yōu)化其鎘吸附條件及研究其吸附鎘的機(jī)理。