湯晶晶，繆婧，崔月花

(揚(yáng)州大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225009)

食用菌含有獨(dú)特的風(fēng)味，主要源于其含有的八碳揮發(fā)性化合物、含硫化合物及醛、酸、酮和酯類等揮發(fā)性的成分，而且食用菌的品種、生長部位及發(fā)育階段、培養(yǎng)方式、儲藏方式、加工方式的差異都會導(dǎo)致食用菌風(fēng)味的變化[1-6]。HUMFELD[7]首次報(bào)道液體深層發(fā)酵技術(shù)不僅可以高產(chǎn)蘑菇菌絲體，同時(shí)也不失蘑菇特有的風(fēng)味，認(rèn)為液體深層發(fā)酵技術(shù)可在風(fēng)味物質(zhì)的生產(chǎn)應(yīng)用上發(fā)揮重大作用。KAWABE等[8]在117種蕈菌的液體培養(yǎng)液中鑒定出47種化合物，其中有14種揮發(fā)性化合物首次在蕈菌的液體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，其中最多的組分是苯甲醛，占整個(gè)風(fēng)味物質(zhì)的61%，其他還含有一些芳香化合物和醇類，其中3-甲基-1-丁醇的含量最高；在培養(yǎng)基中添加L-苯丙氨酸，發(fā)現(xiàn)苯甲醛和苯甲醇的含量會顯著增加，說明蕈菌獨(dú)特風(fēng)味不僅和培養(yǎng)基的成分等有關(guān)外，還說明蕈菌獨(dú)特的風(fēng)味是許多風(fēng)味物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

桑黃(Phellinuslinteus)作為一種重要的藥用真菌，目前對桑黃的研究主要集中在藥理和藥用成分的研究中[9-11]，對桑黃特殊風(fēng)味物質(zhì)的研究國內(nèi)外鮮有報(bào)道。盡管目前桑黃已經(jīng)能夠人工栽培，但桑黃子實(shí)體栽培時(shí)間長，而液態(tài)發(fā)酵是使桑黃規(guī)模化生產(chǎn)的最佳方式。所以研究菌絲體和發(fā)酵液的化學(xué)成分對工業(yè)化生產(chǎn)更具現(xiàn)實(shí)意義，而且許多研究表明菌絲體和子實(shí)體具有同樣價(jià)值和藥理功效[9,12-15]。本實(shí)驗(yàn)室利用液體發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵，獲得菌絲體和發(fā)酵液，應(yīng)用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法初步對桑黃液體發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液及固態(tài)發(fā)酵菌絲中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析研究，旨在了解桑黃菌絲體和發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成的特性，為利用桑黃液體深層發(fā)酵技術(shù)來生產(chǎn)天然風(fēng)味化合物及食品添加劑原料提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

桑黃(Phellinuslinteus,P.linteus)菌種為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 材料

麩皮等，購于農(nóng)貿(mào)市場；葡萄糖等化學(xué)試劑，購于國藥集團(tuán)。

1.3 儀器

SPME手動進(jìn)樣手柄，美國Supelco公司；75 μm CAR/PDMS萃取頭,美國Supelco公司；Trace MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司。

1.4 方法

1.4.1 桑黃培養(yǎng)

(1)培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)。

麩曲培養(yǎng)基(g∶mL)：麩皮∶水=1∶1.2。

液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，玉米粉30，麩皮10，豆餅粉5，KH2PO43，MgSO41.5。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖55，玉米粉20，麩皮10，豆餅粉5，KH2PO43，MgSO41.5。

(2)種子培養(yǎng)

將斜面菌種接種在PDA培養(yǎng)基中，26 ℃下培養(yǎng)，長滿斜面后待用。

液體種子培養(yǎng)：將斜面種子分割成約0.5 cm2的小塊轉(zhuǎn)接到液體種子培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：250 mL 三角瓶，裝量70 mL，搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min，在26 ℃條件下培養(yǎng)10 d。

(3)液體發(fā)酵

在500 mL三角瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基140 mL，接種量10%，轉(zhuǎn)速150 r/min，26 ℃下培養(yǎng)，待原料完全被菌絲分解吸收結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液4 000 r/min離心30 min得菌絲及發(fā)酵清液。菌絲體用流水沖洗凈，除掉雜質(zhì)，離心收集菌絲體。

(4)固態(tài)培養(yǎng)

將斜面菌種0.5 cm2接種于麩曲培養(yǎng)基中，在26 ℃ 下進(jìn)行培養(yǎng)，待菌絲長滿，原料被完全分解吸收時(shí)結(jié)束發(fā)酵。

1.4.2 樣品的制備及分析參照[16-17]

將固相微萃取頭于氣相色譜儀進(jìn)樣口250 ℃老化5～10 min。分別取發(fā)酵液10 mL，研碎的鮮菌絲10 g，剪碎的鮮固態(tài)發(fā)酵菌絲10 g，裝入250 mL三角瓶中，封嚴(yán)密閉。將固相微萃取器的萃取頭通過聚四氟乙烯隔墊插入到樣品瓶頂空萃取45 min，萃取溫度為60 ℃，然后將萃取頭抽出，插入GC-MS進(jìn)樣口，于250 ℃解吸1 min，進(jìn)行GC-MS檢測。氣相色譜條件：HP25(30 m×25 mm, 25 μm)毛細(xì)管柱；載氣為He；流量1.0 mL/min，進(jìn)樣口采用不分流模式；程序升溫：進(jìn)樣口溫度250 ℃，起始溫度35 ℃，停留5 min，以3 ℃/min升至150 ℃，然后以10 ℃/min升至240 ℃， 最后停留2 min。質(zhì)譜條件：質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，電離方式EI，離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍為40～500 u，檢索譜庫為Nist05a。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

利用NIST11譜庫的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對得到的譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索和解析，選擇匹配度>800的作為物質(zhì)鑒定依據(jù)。比對相關(guān)質(zhì)譜資料，對基峰、m/z和相對豐度等方面進(jìn)行分析，結(jié)合保留時(shí)間和MS對樣品中各揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析。釆用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件的選擇

2.1.1 萃取時(shí)間

選取30、45、60 min考察萃取時(shí)間對桑黃揮發(fā)性成分的影響，萃取溫度固定在50 ℃，氣-質(zhì)聯(lián)用分析儀所檢出的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量和總含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))如圖1。圖1表明,萃取時(shí)間由30 min增加到45 min，檢出的揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量和總質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加；但在45 min后，呈現(xiàn)下降趨勢，所以樣品萃取時(shí)間以45 min為宜。

a-揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量；b-揮發(fā)性物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)圖1 萃取時(shí)間對檢出的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量和總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effect of extraction time on the quantity and total mass fraction of volatile substances detected

2.1.2 萃取溫度

樣品萃取時(shí)間固定于45 min,考察40、50、60 ℃對檢出的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量和總含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的影響。圖2表明,隨著溫度升高，檢出的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量和總含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))都呈現(xiàn)增加趨勢，考慮到溫度高于60 ℃后，對桑黃風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的化合物容易分解而損失，因此，萃取溫度選擇60 ℃。

2.2 不同樣品的揮發(fā)性組分的GC-MS分析結(jié)果

圖3～圖5是在萃取時(shí)間45 min、萃取溫度60 ℃時(shí)氣-質(zhì)聯(lián)用分析桑黃發(fā)酵液、桑黃液態(tài)發(fā)酵菌絲、桑黃固態(tài)發(fā)酵菌絲的揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖，表1～表3是化合物鑒定結(jié)果。

a-揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量;b-揮發(fā)性物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)圖2 萃取溫度對檢出的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量和總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the quantity and total mass fraction of volatile compounds detected

2.2.1 桑黃發(fā)酵液的揮發(fā)性組分GC-MS分析

通過譜庫檢索在發(fā)酵液中鑒定出20種揮發(fā)性風(fēng)味化合物(圖3)，占整個(gè)揮發(fā)性化合物的92.29%。其中醇類5種、酯類5種、芳香烴類3種、烷烴類2種、生物堿類2種、酮類1種、酸類1種、醌類1種，揮發(fā)性風(fēng)味化合物及相對百分含量見表1。各類化合物比例為酯類化合物41.43%、醇類34.06%；芳香烴類6.95%、生物堿類4.02%、醌類1.51%、烷烴類1.03%、 酮類1.31%、酸類0.51%。

圖3 桑黃發(fā)酵液揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion flow chromatography of volatile components in fermentation broth of P. linteus

表1 固相微萃取/氣-質(zhì)聯(lián)用儀檢出的桑黃發(fā)酵液的揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components in P. linteus fermentation broth detected by solid phase microextraction/GC-MS

2.2.2 桑黃液態(tài)發(fā)酵菌絲的揮發(fā)性組分的GC-MS分析

通過譜庫檢索在液態(tài)發(fā)酵的菌絲中鑒定出25種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，占整個(gè)揮發(fā)性化合物的91.51%。其中烷烴類6種、醇類5種、酯類3種、烯烴類3種、酸類2種、生物堿類2種、芳香烴類1種、酚類1種，酮類1種，醛類1種，揮發(fā)性風(fēng)味化合物及相對含量(%)見表2。對各類化合物分析表明，烷烴類占整個(gè)揮發(fā)性化合物的36.95%、醇類22.24%、烯烴類16.5%、酯類6.3%、生物堿類5.84%、酸類3.05%、醛類1.2%、酚類1.29%、芳香烴類0.63%、酮類0.52%(圖4)。

圖4 桑黃液態(tài)發(fā)酵菌絲的揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion flow chromatography of volatile components in mycelium of P. Linteus by liquid fermentation

2.2.3 桑黃固態(tài)發(fā)酵菌絲的揮發(fā)性組分GC-MS分析

通過譜庫檢索在固態(tài)發(fā)酵菌絲體重鑒定出29種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，占整個(gè)揮發(fā)性化合物的91.06%。其中烷烴類8種、醇類7種、酯類5種、醛類2種、芳香烴類2種、酸類2種、酮類2種，揮發(fā)性風(fēng)味化合物及相對含量(%)見表3。對各類化合物分析說明：烷烴類51.19%、醛類9.33%、酯類8.96%、醇類8.91%、芳香烴類2.44%、酮類3.55%、酸類2.12%(圖5)。

表2 固相微萃取/氣-質(zhì)聯(lián)用儀檢出桑黃液態(tài)發(fā)酵菌絲的揮發(fā)性成分Table 2 Volatile components in mycelium of P. linteus by liquid fermentation detected by solid phase microextraction/GC-MS

圖5 桑黃固態(tài)發(fā)酵菌絲的揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.5 Total ion flow chromatography of volatile components in mycelium of P. linteus by solid fermentation

2.3 桑黃菌發(fā)酵液、桑黃液態(tài)發(fā)酵菌絲及固態(tài)發(fā)酵菌絲揮發(fā)性組分的比較

2.3.1 烴類物質(zhì)

由表4可以看出，發(fā)酵液中烴類占7.98%，主要是芳香烴類，烷烴比例較少；而菌絲中烴類種類較多，含量高達(dá)54.08%，其中烷烴、烯烴分別為36.95%，16.5%，芳香烴含量和種類較少；固態(tài)菌絲中烴類占53.63%，主要是烷烴類，芳香烴類種類較少，占2.44%， 這與液態(tài)發(fā)酵菌絲體在烷烴和芳香烴含量上基本相似。

表3 固相微萃取/氣-質(zhì)聯(lián)用儀檢出桑黃固態(tài)發(fā)酵菌絲的揮發(fā)性成分Table 3 Volatile components in mycelium of P. linteus by solid fermentation detected by solid phase microextraction/GC-MS

表4 桑黃菌發(fā)酵液、桑黃液態(tài)發(fā)酵菌絲及固態(tài)發(fā)酵菌絲中含醇類情況Table 4 Hydrocarbon in fermentation broth, mycelium of P. linteus by liquid and solid fermentation

注：+代表含有該物質(zhì)。下同。

2.3.2 醇類化合物

由表5可知，3種樣品中醇類化合物的相對含量及種類不同。

發(fā)酵液中醇類相對含量最大，主要為萜烯醇、十一醇、桉葉醇、2-乙基己醇和3-甲基丁醇；液體發(fā)酵菌絲體中所含有的5種醇類相對含含量為28.01%，主要為油醇、萜烯醇、十四烷醇、十一醇、桉葉醇，菌體細(xì)胞能合成這5種醇類，而固態(tài)發(fā)酵菌絲中醇類種類較多，相對含量只占8.91%，含有十八烷醇、2-乙基己醇、苯基乙醇、桉葉醇、十一醇、1-十四烷醇、愈創(chuàng)甘油醚。

表5 桑黃菌發(fā)酵液、桑黃液態(tài)發(fā)酵菌絲及固態(tài)發(fā)酵菌絲中含醇類情況Table 5 Alcohols in fermentation broth, mycelium of P. linteus by liquid and solid fermentation

2.3.3 酯類

酯類化合物是一類馥郁芳香味的物質(zhì)。從表6可知，桑黃發(fā)酵液、液態(tài)發(fā)酵菌絲、固態(tài)發(fā)酵菌絲體中酯類相對含量分別為41.43%、6.3%、8.96%，在桑黃的風(fēng)味物質(zhì)中起到重要作用。桑黃發(fā)酵液中主要含有乙酸正戊酯、鄰苯二甲酸二丁酯、9(順)十八烯酸甲酯及角鯊?fù)?，其中角鯊?fù)楹枯^多。菌絲體中主要酯類物質(zhì)是9-十八烯酸甲酯、肉豆蔻酸異丙酯和鄰苯二甲酸二丁酯；固態(tài)發(fā)酵菌絲中含有的酯類種類較多，除不含乙酸正戊酯外，其余幾種酯類均含有。

2.3.4 酮類、酸類、醛類、生物堿類

分析表明,發(fā)酵液中含有丙酸睪丸酮占1.31%，發(fā)酵菌絲中的2,6 二(1,1二甲乙基)2,5-環(huán)己二烯-1,4-二酮相對含量為0.52%，而固態(tài)發(fā)酵的菌絲中含有甲基異丁基甲酮，2-十一酮為3.55%。比較而言，酮類化合物在桑黃固態(tài)發(fā)酵菌絲體揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量比其他兩種樣品都高。

桑黃固態(tài)菌絲體中檢測到2種酸類化合物：壬酸，葉酸相對含量分別為0.89%、1.23%；而液態(tài)發(fā)酵菌絲中十一碳烯酸、葉酸類物質(zhì)相對含量為1.92%、1.13%；發(fā)酵液中壬酸為0.71%，液態(tài)發(fā)酵中酸為2.83%，而固態(tài)發(fā)酵總酸為3.05%。

固態(tài)發(fā)酵菌絲中檢測到戊二醛及安息香醛，相對含量占整個(gè)風(fēng)味物質(zhì)的9.33%，液態(tài)發(fā)酵中醛類占1.2%，僅存于菌絲體中，而發(fā)酵液中則未檢出。

桑黃液態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生生物堿類物質(zhì)，其中發(fā)酵液中含2種乙二胺和1-丁胺，菌絲中含2種，1-丁胺和秋水仙堿，而固態(tài)發(fā)酵中不含生物堿類。生物堿本身是苦味物質(zhì)，發(fā)酵液的清苦味和固態(tài)菌絲的芳香味不同，是否與含有生物堿類有關(guān)需要進(jìn)一步的探討。

液態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵液中含有醌類2,6-二叔丁基苯醌1.51%，而發(fā)酵菌絲均不含有醌類物質(zhì)；液態(tài)發(fā)酵菌絲中含有酚類2，4-二叔丁基苯酚1.29%，而固態(tài)菌絲不含酚類物質(zhì)。酚類是否對桑黃的呈味起到貢獻(xiàn)，需要進(jìn)一步的研究。

3 討論

作為食用菌品質(zhì)的重要指標(biāo)，對揮發(fā)性風(fēng)味成分的組成和含量的研究有助于我們深入了解食用菌的風(fēng)味特征，對菌種的改良、定向培育及儲藏加工等方面的應(yīng)用具有指導(dǎo)作用和實(shí)踐意義[18-20]。

液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵中形成烴的含量和種類說明烷烴類在菌絲體中揮發(fā)性物質(zhì)中發(fā)揮重要作用。發(fā)酵液中僅檢測到芳香烴類及少量烷烴類物質(zhì)，說明烷烴為胞內(nèi)物質(zhì)，由菌絲體細(xì)胞合成的。芳香烴烴類是否是基質(zhì)中的揮發(fā)性成分或是發(fā)酵過程中釋放的揮發(fā)性物質(zhì)，有待進(jìn)一步的研究。

3種樣品中醇類相對含量比較高，說明醇類化合物是主要的揮發(fā)性物質(zhì)，但研究表明八碳化合物(C8H16O)是食用菌最重要的風(fēng)味物質(zhì)，其中1-辛烯-3-醇具有濃烈的蘑菇味道[21-22]，但在本研究中發(fā)現(xiàn)，桑黃的固體發(fā)酵菌絲和液體發(fā)酵菌絲及發(fā)酵液中八碳化合物種類極少，僅含3,3-三甲基-2-氧雜二環(huán)[2.2.2]辛烷桉葉醇、 2-乙基己醇兩種八碳醇類，而酯類化合物并無八碳酯類，這與1-辛烯-3-醇是食用菌中最具特征的風(fēng)味化合物的結(jié)論不同[23-24]。而且分析發(fā)現(xiàn)醇類化合物在發(fā)酵液中的含量遠(yuǎn)高于菌絲，說明醇類物質(zhì)容易分泌于胞外。2-乙基己醇在固態(tài)發(fā)酵菌絲和發(fā)酵液中均含有，是菌絲細(xì)胞合成還是培養(yǎng)基本身帶來的揮發(fā)性物質(zhì)需進(jìn)一步的研究。

酯類物質(zhì)具有濃郁的芳香氣味。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)液態(tài)發(fā)酵菌絲體含有9(順)十八烯酸甲酯，鄰苯二甲酸二丁酯、角鯊?fù)?、肉豆蔻酸異丙酯，說明菌絲體細(xì)胞本身能夠合成這類物質(zhì)。而液態(tài)發(fā)酵菌絲體及發(fā)酵液無鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二辛酯，說明培養(yǎng)基無此揮發(fā)性物質(zhì)，主要由菌絲體細(xì)胞產(chǎn)生，這與發(fā)酵形式、發(fā)酵時(shí)間有關(guān)。陳志杰等[23]分析發(fā)現(xiàn)主要靈芝菌絲體中酯類物質(zhì)是3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯酸甲酯(3.26%)、鄰苯二甲酸二丁酯(1.23%)和苯甲酸甲酯(0.92%)，而邢增濤等[25]發(fā)現(xiàn)姬松茸子實(shí)體中酯類物質(zhì)含量較少，而我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中酯類物質(zhì)相對含量更多，說明發(fā)酵方式對酯類的影響較大，但桑黃子實(shí)體中酯類含量和種類是否與姬松茸相同，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。角鯊?fù)橹饕嬖谟邗忯~肝油中，少量存在于橄欖油、米糠油、麥胚油、酵母及人體脂肪中，對皮膚具有保護(hù)作用[26]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)角鯊?fù)樵诎l(fā)酵液中含量較大，通過液態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)角鯊?fù)榫哂幸欢ǖ慕?jīng)濟(jì)意義。

醛類在固態(tài)發(fā)酵中產(chǎn)生量較大，而發(fā)酵液中無醛類，說明菌絲細(xì)胞能夠合成醛類。褚東陽等[6]研究發(fā)現(xiàn)醛類是蛹蟲草揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要來源，可見醛類也是風(fēng)味物質(zhì)中起到一定呈味作用的物質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)對桑黃液體發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步分析，未比對桑黃子實(shí)體中揮發(fā)性成分，這些揮發(fā)性物質(zhì)是否都是由細(xì)胞合成的及代謝過程未進(jìn)行深入的研究和探討，隨著分離技術(shù)及儀器的發(fā)展，風(fēng)味物質(zhì)的形成過程、分離純化及鑒定將在風(fēng)味物質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性和風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理等方面打開新的局面，并在將來真菌的風(fēng)味物質(zhì)替代人工合成的香料物質(zhì)方面有著極為重要的意義。