任大勇，高良鋒，楊柳，劉宏妍，于寒松，沈明浩

1(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春，130118) 2(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春，130118)

辣白菜是我國北方地區(qū)傳統(tǒng)泡菜的一種，屬于乳酸菌低溫發(fā)酵食品，與其他發(fā)酵蔬菜相似，微生物的代謝不僅賦予辣白菜豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，同時(shí)還產(chǎn)生了獨(dú)特的風(fēng)味[3-4]。這些風(fēng)味主要包括滋味物質(zhì)(有機(jī)酸，氨基酸，糖類等)和香氣物質(zhì)(揮發(fā)性有機(jī)酸，醇類，酯類，芳香族化合物等)[5-6]。經(jīng)過臭氧滅菌處理的原料發(fā)酵得到的辣白菜在風(fēng)味和安全性方面往往不被消費(fèi)者所接受[7]，所以辣白菜的加工過程普遍采用原始生料，發(fā)酵過程利用白菜及配料自身攜帶的微生物來完成[8-9]，這樣豐富的代謝產(chǎn)物和復(fù)雜的微生物之間同樣也會(huì)相互影響，因此目前還沒能找到一種合理的方式來控制整個(gè)辣白菜的發(fā)酵過程中微生物和代謝產(chǎn)物的變化。

接種發(fā)酵通常采用單菌株或多菌株復(fù)合作為發(fā)酵劑，能達(dá)到縮短辣白菜發(fā)酵時(shí)間，延長保質(zhì)期，改變風(fēng)味等目的，是目前發(fā)酵蔬菜行業(yè)中公認(rèn)的有效手段[10-11]。我國對(duì)辣白菜發(fā)酵劑的研究較少，韓國對(duì)于辣白菜發(fā)酵劑的研究較為成熟，已有Leuconostoc.citreumGJ7、Lactobacillus.plantarumPL62及Leuconostoc.mesenteroidesLK93等[12-14]發(fā)酵劑。研究表明辣白菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌種主要包括明串珠菌、乳桿菌、以及魏斯氏菌[15-16]。關(guān)于發(fā)酵劑對(duì)風(fēng)味的影響針對(duì)于明串珠菌的研究較多，但關(guān)于同樣在發(fā)酵過程中起到重要作用的乳桿菌對(duì)于風(fēng)味的貢獻(xiàn)研究卻較少。

乳桿菌是辣白菜發(fā)酵中后期的優(yōu)勢(shì)菌屬之一，這些乳桿菌主要包括植物乳桿菌和沙克乳酸桿菌，但沙克乳酸桿菌很少能從辣白菜中分離出來，相比植物乳桿菌分離培養(yǎng)更加廣泛[17-18]。所以，本研究以前期篩選分離的耐鹽、耐低溫植物乳桿菌作為發(fā)酵劑；通過在辣白菜發(fā)酵前，投入該菌株，研究該菌株對(duì)于辣白菜發(fā)酵過程中微生物的變化，以及對(duì)可滴定酸、氨基酸、可溶性糖以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，為辣白菜發(fā)酵劑的開發(fā)和辣白菜的品質(zhì)控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株:植物乳桿菌L12；大白菜(結(jié)球白菜)、辣椒粉、大蒜、姜、食鹽、白糖等;市售:NaOH、甲醛、HCl、CuSO4、酒石酸鉀鈉、乙酸鋅、冰醋酸、亞鐵氰化鉀(分析純)：北京化工廠；亞甲基藍(lán)(指示劑)：北京益利；MRS肉湯培養(yǎng)基：青島海博。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；5804R離心機(jī)，Eppendorf；BSA2245-CW電子天平，Sartorus；電加熱套、6890N—5975C氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 辣白菜樣品制備

去老葉→切分→稱重→腌制→清洗→抹料→發(fā)酵→保藏

將新鮮白菜去老葉，切分成4瓣，以質(zhì)量為基重，用4% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))食鹽腌制24 h，用清水清洗，瀝干，待用。用適量的熱水燙辣椒粉去苦，冷卻。將蘋果、梨、姜、蒜用搗碎機(jī)打碎成泥狀，按配料比例調(diào)制成辣白菜醬料，按每份占白菜總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)分配醬料，根據(jù)原料質(zhì)量加入2%菌懸液(自然發(fā)酵組加入等量生理鹽水)，混勻。將醬料均勻涂抹在每一片菜葉，放在塑料保鮮盒中密封，于10 ℃發(fā)酵條件下發(fā)酵時(shí)間控制在11 d，每隔1 d取樣1次，將樣品打碎，檢測(cè)各項(xiàng)理化指標(biāo)。

1.3.2 乳酸菌計(jì)數(shù)

依照國標(biāo)GB/T 4789.35—2016[19]檢測(cè)乳酸菌數(shù)量。

1.3.3 可滴定酸檢測(cè)

依照國標(biāo)GB/T 12456—2008[20]，樣品總酸含量≤4 g/kg，以乳酸作為換算系數(shù)，計(jì)算可滴定酸含量。

1.3.4 氨基酸態(tài)氮檢測(cè)

取5 g樣品用50 mL 80 ℃蒸餾水洗滌，冷卻后定容到100 mL，取20 mL濾液加入40 mL水，然后用NaOH溶液(c(NaOH)=0.1 mol/L)滴定至pH 8.2，再加入甲醛溶液10 mL充分混合后滴定至pH 9.2，通過NaOH溶液用量來計(jì)算氨基酸氮含量。

1.3.5 還原糖測(cè)定

依照國標(biāo)GB 5009.7—2016[21]中第一法直接滴定法執(zhí)行操作。

1.3.6 風(fēng)味物質(zhì)分析(GC-MS)

GC條件：載氣為He；恒流；流速1 mL/min，初始溫度60 ℃，保留時(shí)間3 min，以5 ℃/min上升至100 ℃ 后，再以10 ℃/min上升至280 ℃，保留10 min。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，掃描 20～800 u。

1.3.7 微生物多樣性檢測(cè)

將微生物DNA從樣品中抽提出來，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提出的DNA，采用通用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′擴(kuò)增DNA中V3、V4區(qū)域，然后，將所得擴(kuò)增產(chǎn)物通過Miseq建庫并檢測(cè)，將所得結(jié)果采用OTU聚類整合分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

檢測(cè)結(jié)果利用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；GC-MS得到離子色譜圖，通過計(jì)算機(jī)譜庫檢索，去除相似度低于80%組分，確定辣白菜風(fēng)味化學(xué)成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種發(fā)酵對(duì)乳酸菌數(shù)量的影響

發(fā)酵過程中除原料本身外，微生物的代謝對(duì)于辣白菜的風(fēng)味有很大影響，而辣白菜發(fā)酵過程中的微生物以乳酸菌為主。從圖1中可以看出，接種發(fā)酵組在發(fā)酵第5天微生物數(shù)量達(dá)到最高7.34 lg CFU/g，而后基本保持不變，相比之下自然發(fā)酵組在第7天乳酸菌數(shù)量才達(dá)到最高值，且到達(dá)穩(wěn)定期后乳酸菌總數(shù)也略低于接種發(fā)酵組。

圖1 發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量的變化Fig.1 Viability of lactic bacteria during spicy cabbage fermentation

2.2 植物乳桿菌對(duì)pH和可滴定酸的影響

有機(jī)酸是辣白菜中重要風(fēng)味物質(zhì)之一，pH也是用來衡量產(chǎn)品是否發(fā)酵成熟的一個(gè)標(biāo)志。一般認(rèn)為pH值在4.2～5.0時(shí)為最適宜儲(chǔ)藏時(shí)期和最佳的食用時(shí)期。從圖2可知，自然發(fā)酵組pH值和可滴定酸含量變化較為平緩。

A-pH值變化；B-可滴定酸含量變化圖2 發(fā)酵過程中pH值和可滴定酸的變化Fig.2 Change in pH and titratable acidity during spicy cabbage fermentation

隨發(fā)酵時(shí)間的延長，總酸含量不斷增加，pH值不斷下降；而接種發(fā)酵在3～5 d，pH和可滴定酸含量出現(xiàn)較大變化，pH迅速降低，酸度迅速增加，其他時(shí)間變化趨勢(shì)平緩，這與乳酸菌總數(shù)變化的結(jié)果相一致，說明植物乳桿菌的加入能促進(jìn)辣白菜總酸量的增加，并加快成熟速度，縮短發(fā)酵時(shí)間。

2.3 植物乳桿菌對(duì)發(fā)酵過程中還原糖的影響

還原糖是乳酸菌的主要碳源和能量源，糖代謝也是許多風(fēng)味物質(zhì)的形成途徑。由圖3可以看出，在發(fā)酵前3 d，還原糖含量升高，可能是由于這段時(shí)間內(nèi)能分解非還原糖的微生物作用，使樣品中蔗糖等多糖類化合物分解為還原糖，而隨著乳酸菌數(shù)量的增加，對(duì)于還原糖的利用也隨之增加，直至乳酸菌和其他微生物數(shù)量達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定，還原糖含量也相對(duì)穩(wěn)定。相比于自然發(fā)酵，接種發(fā)酵樣品還原糖含量相對(duì)較高，可能是由于在植物乳桿菌的影響下促進(jìn)了體系中非還原糖向還原糖的轉(zhuǎn)化。

圖3 發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.3 Change in reducing sugars during spicy cabbage fermentation

2.4 植物乳桿菌對(duì)氨基酸的影響

通過氨基酸態(tài)氮可以反映出產(chǎn)品中氨基酸的含量，氨基酸也是樣品中的代謝產(chǎn)物，由圖4可知，兩組樣品氨基酸含量都隨著發(fā)酵的進(jìn)行而增加，這與JEONG等[22]對(duì)于辣白菜中的氨基酸研究結(jié)果相近。

圖4 發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化Fig.4 Changes in amino acid content during spicy cabbage fermentation

王曉飛[23]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌能在泡菜發(fā)酵時(shí)通過分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生丙氨酸，精氨酸，異亮氨酸等促進(jìn)氨基酸含量增加，而從圖4結(jié)果也可以看出，接種發(fā)酵組在發(fā)酵過程中氨基酸含量始終高于自然發(fā)酵組，最大氨基酸含量差異出現(xiàn)在第7天，接種發(fā)酵組氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.079 5%之后漲勢(shì)趨于平緩，而自然發(fā)酵組氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第9天達(dá)到0.078%，之后增長率降低。

2.5 植物乳桿菌對(duì)發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響

從上述結(jié)果中可見，在整個(gè)發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量和非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在第1～7天變化較為明顯，所以選取這段時(shí)間內(nèi)的第1天，第4天和第7天3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)檢測(cè)辣白菜的揮發(fā)性風(fēng)味成分。從表1結(jié)果可以看出，兩組辣白菜樣品中共檢測(cè)出揮發(fā)性風(fēng)味成分84種，其中包括硫化物4種、烯烴16種、醇類9種、醛類18種、酮類2種、酸類7種、酯類25種、芳香族化合物3種。其中硫化物在發(fā)酵的前期基本相似，發(fā)酵過程中，接種發(fā)酵樣品中二甲基二硫化物和二甲基三硫化物含量都有所增加，而自然發(fā)酵組中，只有二甲基二硫化物化物在發(fā)酵到第4天時(shí)含量增加，其他各硫化物含量都與發(fā)酵第1天相近；烯烴是2組樣品中含量較高也較豐富的一類成分，2組樣品共有的成分有12種，在不同發(fā)酵時(shí)間含量相近，剩余的4種差異性成分含量均相對(duì)較低；除十二烯醇在發(fā)酵第1天短暫出現(xiàn)外，其他幾種醇類成分幾乎在2組樣品中均有出現(xiàn)，在發(fā)酵的第4天，2組樣品醇類成分種類完全一致，但發(fā)酵到第7天，自然發(fā)酵組中1-己醇和4-萜烯醇兩種物質(zhì)未能測(cè)出；醛類成分也是2組樣品中種類較豐富的物質(zhì)之一，2組中共有的醛類物質(zhì)有11種，但從含量上來看，接種發(fā)酵第1天醛類總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在7.9%，第4天和第7天時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別只有3.62%和4.29%，明顯降低，而自然發(fā)酵組中，1～4 d同樣表現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，但第7天檢查出的含2-壬烯醛(黃瓜味、清香味)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)到12.54%；酮類成分種類相似，自然發(fā)酵組含量略高于接種發(fā)酵組；相比之下，酸類揮發(fā)性成分含量并不高，2組中共有的酸類成分有4種，其余2種均出自于接種發(fā)酵中，說明植物乳桿菌的接種對(duì)揮發(fā)性酸類物質(zhì)的豐富有明顯作用；酯類是揮發(fā)性成分中種類最豐富、含量最高的成分，也是2組間種類差異最大的風(fēng)味物質(zhì)，其中異硫氰酸苯乙酯和3-丁烯基異硫氰酸酯含量是樣品中含量較高的兩種成分，其中差異成分有8種，接種發(fā)酵樣品中有部分酯類成分僅在第1天或第4天測(cè)出，導(dǎo)致第7天時(shí)酯類物質(zhì)種類下降；對(duì)于芳香族化合物兩組間差異不大，只有2,4-二叔丁基酚化合物僅在自然發(fā)酵的第1天和第4天存在。結(jié)合上述結(jié)果，說明植物乳桿菌的接種造成發(fā)酵過程中的風(fēng)味物質(zhì)成分明顯變化，通過感官評(píng)價(jià)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩組樣品最高感官得分相近，說明變化后的風(fēng)味成分并未對(duì)感官造成負(fù)面影響。

表1 辣白菜發(fā)酵過程中主要揮發(fā)性風(fēng)味成分及相對(duì)含量變化Table 1 Changes of main volatile flavor components and relative contents during spicy cabbage fermentation

續(xù)表1

類別物質(zhì)名稱氣味描述相對(duì)含量/%J-1J-4J-7Z-1Z-4Z-7酸類辛酸汗水,奶酪0.21十二烷酸金屬0.13十四烷酸0.120.130.130.110.150.16正十六烷酸0.851.281.330.831.822.03(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸0.110.330.090.2油酸脂肪0.160.15酯類辛酸乙酯水果,脂肪0.130.170.110.21水楊酸甲酯薄荷味0.06異丙酸三異丙酯0.17癸基-3-甲基丁-3-烯基富馬酸酯0.490.653-丁烯基異硫氰酸酯10.559.5211.058.348.728.99二氫獼猴桃內(nèi)脂0.210.180.160.250.240.2212-甲基三癸酸甲酯0.26十四烷酸甲酯鳶尾草味0.34十四烷酸乙酯醚味0.180.120.170.220.220.261,4-甲基-十五烷酸甲酯0.470.350.55十六烷酸甲酯蠟味0.380.470.46(Z)-9-十六碳烯酸甲酯0.05十六碳-9-烯酸酯甲基0.069-十六烯酸乙酯0.230.289,12-十八碳二烯酸甲酯0.088-十八碳烯酸甲酯0.120.18,11-十八碳二烯酸甲酯0.470.380.579-十八碳烯酸甲酯0.10.120.120.159-十八碳烯酸乙酯0.079,12-十八碳二烯酸甲酯0.330.450.450.099,12,15-十八碳三烯酸乙酯0.080.070.140.10.130.12油酸乙酯0.140.060.220.180.26亞油酸乙酯0.650.260.560.810.771.04芐基異硫氰酸酯辛辣0.40.560.350.48異硫氰酸苯乙酯7.714.54.527.915.467.76其他2-甲氧基-4-乙烯基苯酚杏仁0.240.120.152,4-二叔丁基酚0.180.1苯代丙腈0.770.570.670.730.630.67

注： J代表接種發(fā)酵，Z代表自然發(fā)酵。下同。

通過比較各成分相對(duì)含量，2種辣白菜的主要揮發(fā)性成分相似，主要包括二甲基二硫化物(洋蔥味，白菜味)、二甲基三硫化物(白菜味，魚味)、茴香烯、黃姜烯(青草味)、姜烯(香料味，清新味)、紅沒藥烯(香油味)、芳樟醇(花香，薰衣草味)、2-甲基-3-苯基-丙醛、(E，E)-2,4-癸二烯醛(海草味)、3-丁烯基異硫氰酸酯和異硫氰酸苯乙酯。由于發(fā)酵的原料和發(fā)酵工藝的差異，發(fā)酵泡菜的揮發(fā)性風(fēng)味成分也各有不同，主要成分也有差異，但其中二甲基二硫化物、二甲基三硫化物以及異硫氰酸苯乙酯廣泛存在于各種辣白菜中[23-27]，這與本研究的結(jié)果相近。二甲基二硫化物和二甲基三硫化物閾值較低，是辣白菜中重要的風(fēng)味物質(zhì)[23-25]，通過對(duì)比接種發(fā)酵和自然發(fā)酵樣品，二甲基二硫化物和二甲基三硫化物的含量明顯增加，說明該植物乳桿菌對(duì)辣白菜的揮發(fā)性成分有明顯的改善作用。

2.6 植物乳桿菌對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的影響

如圖5所示，當(dāng)發(fā)酵到第7天接種發(fā)酵樣品中乳桿菌占相對(duì)含量的98.16%，明串珠菌占1.08%，魏斯氏菌占0.03%，自然發(fā)酵組中乳桿菌占相對(duì)含量的21.98%，明串珠菌占65.02%。魏斯氏菌占1.1%，從這個(gè)結(jié)果上可以看出，接種發(fā)酵后乳桿菌屬在樣品中占領(lǐng)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，也導(dǎo)致其他細(xì)菌的含量降低，相比于自然發(fā)酵微生物豐富度較低。

圖5 發(fā)酵第7天辣白菜中細(xì)菌物種分布Fig.5 Genus-level distribution of bacterial from spicy cabbage samples at the 7th day of fermentation

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)比自然發(fā)酵和以植物桿菌作為發(fā)酵劑的接種發(fā)酵辣白菜發(fā)酵過程中非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌接種能使辣白菜發(fā)酵過程中乳酸菌總數(shù)增加，從而促進(jìn)非揮發(fā)性酸類物質(zhì)的產(chǎn)生，加快辣白菜的成熟，縮短發(fā)酵周期，酸類物質(zhì)主要由乳酸菌的糖代謝產(chǎn)生，但接種后發(fā)酵的辣白菜樣品中還原糖含量卻高于自然發(fā)酵組，這可能是由于植物乳桿菌在增加還原糖代謝的同時(shí)也促進(jìn)了其他非還原糖向還原糖的轉(zhuǎn)化，同時(shí)，接種發(fā)酵也可以促進(jìn)氨基酸的產(chǎn)生，提高氨基酸總量；從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果表明，無論自然發(fā)酵還是接種發(fā)酵的過程中揮發(fā)性成分都是不斷變化的，植物乳桿菌的接種也造成了揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化，最突出的變化表現(xiàn)在醇類和酸類成分種類的增加以及其中酯類化合物種類的變化。微生物結(jié)果表明，植物乳桿菌接種會(huì)增加發(fā)酵體系中乳桿菌屬的含量，乳桿菌屬大多屬于同型發(fā)酵乳酸菌，產(chǎn)酸量較高，這與非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中酸量增加結(jié)果一致，從風(fēng)味上看也造成部分香氣成分的損失，但二甲基二硫化物和二甲基三硫化物含量明顯增加。

綜上所述，植物乳桿菌的加入，能加快辣白菜的發(fā)酵，縮短發(fā)酵時(shí)間，增加非揮發(fā)性酸的含量和揮發(fā)性酸的種類。雖然其他微生物在發(fā)酵結(jié)束時(shí)含量較低，但它們對(duì)辣白菜風(fēng)味產(chǎn)生的影響同樣不容忽視，在復(fù)雜的發(fā)酵體系中，植物乳桿菌與這些微生物之間的相互作用仍有待于進(jìn)一步研究。