黃瑞杰，藍平，鐘磊，覃琴，藍麗紅，韋佳蔓，廖安平，李媚

(廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西多糖材料及改性重點實驗室(廣西民族大學(xué))，廣西 南寧，530006)

右旋糖酐酶(dextranase)是由微生物產(chǎn)生用來降解右旋糖酐中的α-1，6糖苷鍵，使右旋糖酐鏈縮短、分子質(zhì)量降低的酶類[1]。內(nèi)切型的右旋糖酐酶隨機水解右旋糖酐的α-1，6糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要是異麥芽糖、異麥芽三糖和低聚異麥芽糖以及系列中低分子質(zhì)量的多糖[2]。內(nèi)切型的右旋糖酐酶在食品、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[3-5]。右旋糖酐酶法可取代傳統(tǒng)的酸解法降解右旋糖酐，降低能耗、減輕污染，得到均一性好、雜質(zhì)少的特定分子質(zhì)量的右旋糖酐產(chǎn)品[6]。在諸多右旋糖酐酶產(chǎn)生菌中，青霉菌來源的右旋糖酐酶酶活力高、溫度耐受性好、pH適用范圍寬[7-8]，青霉菌類右旋糖酐酶具有極高的應(yīng)用價值。國內(nèi)外對于菌體發(fā)酵右旋糖酐酶的研究主要集中在菌種篩選[9]、發(fā)酵培養(yǎng)基[10]和培養(yǎng)條件[11-12]的優(yōu)化、右旋糖酐酶的純化[13-14]和酶學(xué)性質(zhì)[15-17]等方面，對菌體發(fā)酵過程動力學(xué)的研究和報道較少[18]。本實驗在前期對圓弧青霉發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵過程動力學(xué)進行研究。考察發(fā)酵過程中菌體質(zhì)量濃度、右旋糖酐酶酶活以及總糖(底物)質(zhì)量濃度隨時間的變化，選擇適當(dāng)?shù)膭恿W(xué)模型對發(fā)酵過程進行擬合，獲得圓弧青霉發(fā)酵過程動力學(xué)模型，并對此模型進行誤差分析，為圓弧青霉發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶發(fā)酵過程優(yōu)化以及大型反應(yīng)器設(shè)計提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

右旋糖酐T70(Mw≈70 kDa)(分析純)，damas-beta試劑公司；98%濃硫酸(分析純)，成都市科隆化學(xué)有限公司；蒽酮(分析純)，aladdin試劑公司；圓弧青霉(P.cyclopium，CICC-4022)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30、NaNO33、KCl 0.5、 MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、K2HPO41.0，pH 6.0～6.2；

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：右旋糖酐30、酵母膏4、ρ(KCl)∶ρ(FeSO4·7H2O)=10∶1、K2HPO41.0， pH 6.0。

1.2 材料與儀器

LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠； LT-XT搖床，瑞士Kuhner AG；ACB-4A1垂直流超凈工作臺，新加坡藝思高科技有限公司；SZ-97自動三重二次蒸餾水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；THS-15數(shù)控超級恒溫槽，寧波天恒儀器廠；UV-4802H雙光束紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；H1850R冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 粗酶液制備

裝液量60 mL、接種量3%、培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH 6.0、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下恒溫培養(yǎng)72 h。取發(fā)酵液于10 000 r/min，4 ℃離心20 min后，取上清液即得粗酶液，稀釋數(shù)倍供酶活和總糖質(zhì)量濃度測定使用。

1.3.2 菌體質(zhì)量濃度的測定

用干重法測定菌體干重，將發(fā)酵液離心后抽濾得到菌體，用蒸餾水洗3次，于80 ℃的烘箱中烘干至恒重，用分析天平測定濾紙前后的質(zhì)量差即為菌體干重m(g)。根據(jù)菌體質(zhì)量與發(fā)酵液體積(60 mL)計算菌體質(zhì)量濃度ρ(g/L)，如公式(1):

(1)

1.3.3 右旋糖酐酶酶活測定

取1 mL質(zhì)量濃度為30 g/L的右旋糖酐T70(0.02 mol/L， pH 5.0的醋酸鹽緩沖液配制)預(yù)熱后與1 mL稀釋過的粗酶液混勻，置于50 ℃恒溫水浴保溫10 min，反應(yīng)結(jié)束取1 mL反應(yīng)液于25 mL的具塞試管中，加入1 mL DNS試劑后，沸水浴后冷卻定容，在540 nm處測定吸光度值，以同等條件下沸水浴10 min 滅活的酶液作為對照，計算酶活，如公式(2)所示。右旋糖酐酶的酶活用水解底物產(chǎn)生的還原糖的量來表示。右旋糖酐酶酶活力定義為：在pH 5.0、50 ℃，每小時水解右旋糖酐T70釋放出1 mg還原糖(葡萄糖當(dāng)量)為1個酶活單位(U)[19]。

右旋糖酐酶活/(U·mL-1)=

(2)

1.3.4 總糖質(zhì)量濃度的測定

采用蒽酮硫酸法測總糖質(zhì)量濃度[20]。

1.3.5 發(fā)酵過程曲線的繪制

進行圓弧青霉的發(fā)酵培養(yǎng)，從接種時起，每隔8 h取樣，采用1.3.2、1.3.3、1.3.4的方法進行圓弧青霉菌體質(zhì)量濃度、右旋糖酐酶酶活和右旋糖酐的質(zhì)量濃度的測定，分別得到圓弧青霉菌體生長、右旋糖酐酶生成和總糖消耗的試驗數(shù)據(jù)。采用Origin 8.0軟件制作圓弧青霉發(fā)酵右旋糖酐酶的過程曲線。

1.3.6 發(fā)酵動力學(xué)模型的建立

1.3.6.1 菌體生長動力學(xué)模型的建立

微生物發(fā)酵動力學(xué)模型有Monod方程，Tessier方程，Contois方程，Moser方程和Logistic方程[21]。采用Logistic方程建立菌體生長動力學(xué)模型表示圓弧青霉菌體質(zhì)量濃度與時間的關(guān)系。Logistic方程如公式(3)：

(3)

式中：X表示菌體質(zhì)量濃度，g/L；μmax表示最大比生長速率，h-1； Xmax表示最大菌體質(zhì)量濃度，g/L；t為發(fā)酵時間，h。

當(dāng)t=0時，X=X0，X0(g/L)為初始菌體質(zhì)量濃度，對公式(3)積分得公式(4)：

(4)

1.3.6.2 右旋糖酐酶生成動力學(xué)模型的建立

選用Leudeking-Piret方程來擬合菌體產(chǎn)酶的過程。

Leudeking-Piret方程為公式(5)：

(5)

式中：P為右旋糖酐酶酶活，U/mL；α為與菌體生長率相關(guān)的產(chǎn)物合成參數(shù)；β是非伴隨菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物合成參數(shù)。

產(chǎn)物合成與菌體生長有偶聯(lián)型、部分偶聯(lián)型、非偶聯(lián)型。α≠0，β=0，產(chǎn)物與菌體生長屬于生長偶聯(lián)型；α=0，β≠0，為非生長偶聯(lián)型；α≠0，β≠0，為部分生長偶聯(lián)型[22]。當(dāng)產(chǎn)菌體生長于產(chǎn)物生成是偶聯(lián)型時，α≠0，β=0。

將公式(3)帶入公式(5)得公式(6)：

(6)

將公式(6)積分得公式(7)。

(7)

1.3.6.3 右旋糖酐消耗動力學(xué)模型的建立

選用類Leudeking-Piret方程用來描述發(fā)酵過程中底物消耗的過程。

類Leudeking-Piret方程如公式(8):

(8)

式中:S為發(fā)酵液中總糖質(zhì)量濃度,g/L；m為維持菌體新陳代謝因數(shù),s-1；YX/S為相對于底物消耗的菌體得率系數(shù)；YP/S為相對于底物消耗的產(chǎn)物得率系數(shù)。

碳源消耗主要用于菌體生長和右旋糖酐酶的誘導(dǎo)合成時，用來維持細胞生理活動所需消耗的底物較小，可以忽略[23]，即m=0。右旋糖酐消耗動力學(xué)模型可表示為公式(9):

(9)

式中:k1代表用于菌體生長的底物消耗常數(shù)，k2代表用于產(chǎn)物形成的底物消耗常數(shù)。

將公式(9)積分得公式(10):

(10)

式中，S0為發(fā)酵液中總糖初始質(zhì)量濃度，g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 圓弧青霉發(fā)酵過程研究

按照1.3.5方法得到發(fā)酵過程中圓弧青霉生長、右旋糖酐酶生成以及右旋糖酐消耗的曲線，如圖1所示。

圖1 菌體質(zhì)量濃度、右旋糖酐酶酶活、右旋糖酐質(zhì)量濃度隨時間的變化Fig.1 Changes of cell mass concentration, dextranase activity and dextran mass concentration with time

由圖1可知，接種初期圓弧青霉菌(CICC-4022)生長緩慢，隨后生長速率逐漸增大，最后趨于穩(wěn)定。0～40 h處于生長延滯期，圓弧青霉菌在這一時期生長速度較慢，幾乎不產(chǎn)右旋糖酐酶，底物消耗的較少；40～72 h處于對數(shù)生長期，圓弧青霉菌體繁殖速度加快，菌體質(zhì)量濃度增加，右旋糖酐酶大量產(chǎn)生，底物被大量消耗；發(fā)酵72～120 h，圓弧青霉菌的生長進入穩(wěn)定期，菌體繁殖緩慢并逐漸呈現(xiàn)死亡狀態(tài)，右旋糖酐酶合成速度減慢，圓弧青霉質(zhì)量濃度和右旋糖酐酶都處于相對平衡狀態(tài)，變化較小。由圖1可知產(chǎn)酶和菌體生長密切相關(guān)，基本同步，說明圓弧青霉(CICC-4022)發(fā)酵右旋糖酐酶的過程屬于生長偶聯(lián)型。

2.2 圓弧青霉生長動力學(xué)模型

由圖1可知，圓弧青霉的生長曲線接近于S型曲線，Logistic方程是一個典型的S型方程[24-25]， Logistic方程適用于擬合圓弧青霉的生長過程。

Logistic方程的積分式為公式(4)。式中X0=0.003 3 g/L。 根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，用Origin 8.0擬合得出參數(shù)值；μmax=0.128 3 h-1，Xmax=9.551 7 g/L。

圓弧青霉生長動力學(xué)模型為公式(11):

(11)

2.3 右旋糖酐酶生成動力學(xué)模型

選用Leudeking-Piret方程來擬合菌體產(chǎn)酶的過程。由圖1可知，圓弧青霉發(fā)酵過程中，右旋糖酐酶的生成與菌體生長基本同步，因此圓弧青霉發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的過程屬于生長偶聯(lián)型，α≠0，β=0。

Leudeking-Piret方程的積分式為公式(7)。式中X0=0.003 3 g/L，μmax=0.128 3 h-1，Xmax=9.551 7 g/L。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，用Origin 8.0擬合得出參數(shù)值，α=6.325 1。

圓弧青霉發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的動力學(xué)模型為公式(12):

(12)

2.4 右旋糖酐消耗動力學(xué)模型

右旋糖酐是圓弧青霉發(fā)酵過程中的唯一碳源，主要用于維持細胞生長、菌體新陳代謝和誘導(dǎo)產(chǎn)物的合成[24]。通過菌體發(fā)酵過程中的底物消耗曲線可知，類Leudeking-Piret方程可以用來描述發(fā)酵過程中底物消耗的過程。發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)如表1所示。

類Leudeking-Piret方程的積分式為公式(10)。式中S0=33.269 6 g/L，X0=0.003 3 g/L，μmax=0.128 3 h-1，Xmax=9.551 7 g/L，α=6.325 1，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，用Origin 8.0擬合的出參數(shù)：k1=1.186 8，k2=0.056 8。

發(fā)酵過程中底物消耗動力學(xué)模型為公式(13):

(13)

表1 發(fā)酵動力學(xué)模型參數(shù)Table 1 Parameter values in kinetic models of fermentation

2.5 擬合曲線分析

根據(jù)發(fā)酵過程中菌體生長、右旋糖酐酶生成和底物消耗的動力學(xué)模型，應(yīng)用Origin 8.0得到圓弧青霉發(fā)酵過程中的動力學(xué)模型擬合曲線，結(jié)果如圖2～圖4所示。

圖2 菌體生長動力學(xué)模型擬合曲線Fig.2 Cell growth kinetics model fitting curve

圖3 右旋糖酐酶生成動力學(xué)模型擬合曲線Fig.3 Dxtranase production kinetics model fitting curve

圖4 底物消耗動力學(xué)模型擬合曲線Fig.4 Dextran consumption kinetic mobel fitting curve

菌體質(zhì)量濃度、右旋糖酐酶酶活和總糖質(zhì)量濃度的實測值、計算值相對誤差如表2所示。

圖2～圖4分別為圓弧青霉生長、右旋糖酐酶生成和底物消耗的動力學(xué)模型的擬合曲線，菌體生長動力學(xué)、右旋糖酐酶生成動力學(xué)和底物消耗動力學(xué)模型擬合度相關(guān)系數(shù)R2分別為0.994、0.992、0.991，說明這3個動力學(xué)模型可很好地反映菌體生長、右旋糖酐酶生成和底物消耗的過程。

由表2可知，40 h之前菌體質(zhì)量濃度和右旋糖酐酶酶活相對誤差較大，基本>20%，可能是因為菌體處于生長停滯期，菌體質(zhì)量濃度和右旋糖酐酶酶活數(shù)值上較小，造成較大的實驗測量誤差[23-24]；40 h之后，菌體生長進入對數(shù)期，菌體質(zhì)量濃度與右旋糖酐酶活逐漸增大，測量誤差較小，相對誤差隨之減小，實驗數(shù)據(jù)擬合較好。發(fā)酵過程中總糖消耗相對誤差全部<7%，擬合良好，主要是因為總糖在研究的發(fā)酵過程中消耗較少，測量誤差較小?？偟膩碚f，發(fā)酵過程中的3條曲線可以較好地反映圓弧青霉的生長、右旋糖酐酶的產(chǎn)生和總糖消耗的規(guī)律。

表2 菌體質(zhì)量濃度、酶活、總糖質(zhì)量濃度實測值與計算值的比較Table 2 Comparison between experimental and predicted values of cell mass concentration，dextranase activity，total sugar mass concentration

3 結(jié)論

通過以上動力學(xué)研究可以看出，圓弧青霉菌的比生長速率、右旋糖酐酶的比生成速率在整個發(fā)酵反應(yīng)過程是隨時間變化的，圓弧青霉的比生長速率的最大值和右旋糖酐酶比生成速率的最大值均出現(xiàn)在菌體由延滯期向?qū)?shù)生長期的過渡期。在實際生產(chǎn)中，可以結(jié)合該試驗得出的動力學(xué)模型對生產(chǎn)進行監(jiān)控，并可以考慮在菌體生長對數(shù)期添加營養(yǎng)物質(zhì)，提高右旋糖酐酶的產(chǎn)量，提高生產(chǎn)效率。