鄭丹丹 黃 倩 梁青龍 陳慧勤 王梅愛 黃秋虹 陳泓臻 張華華

血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)在缺血性臟器損傷的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，抑制Ang Ⅱ的產(chǎn)生并干擾其作用是缺血性臟器損傷治療的關(guān)鍵所在[1]。厄貝沙坦是一種新型且長效的Ang Ⅱ受體(AT)拮抗劑，通過選擇性的與受體1(AT1)結(jié)合而完全阻斷Ang Ⅱ的效應(yīng)。眾所周知，厄貝沙坦因降低血壓、預(yù)防心室重構(gòu)而被廣泛應(yīng)用于臨床?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)其還具有多種生物活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡等[2～5]。近年來發(fā)現(xiàn)其對心、腦缺血再灌注損傷有確切的保護(hù)作用[6～8]。

腎缺血再灌注損傷(RIRI)是臨床常見的病理過程，心臟暫停、休克、呼吸衰竭、腎移植等均可導(dǎo)致RIRI。關(guān)于RIRI的發(fā)生機(jī)制目前尚未完全闡明，有研究證實(shí)可能與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[9]。因此，從抗氧化應(yīng)激損傷角度出發(fā)探索藥物防治RIRI是一種舉措。抗氧化劑是一類能幫助捕獲并清除自由基，從而減輕對機(jī)體損害的一類物質(zhì)?，F(xiàn)存有很多種類抗氧化劑，如維生素C(Vit C)、脂溶性的維生素E(Vit E)，此外，常見的還有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等。研究發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦有強(qiáng)效的抗氧化作用，可清除體內(nèi)活性氧簇(ROS)，但是否對RIRI有效應(yīng)，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道[3]。本研究通過建立RIRI小鼠模型，觀察厄貝沙坦對RIRI的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制，旨在為臨床防治急性腎損傷提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.儀器：全自動生化分析儀(上海恒盛醫(yī)療器械有限公司)；普通電冰箱(中國Haier公司)；超低溫冰箱(美國NuAir公司)；Bio-Rad垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；Alpha凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha公司)；智能型全自動熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)等。

2.動物：健康SPF級C57BL/6小鼠40只[購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2007-0005，使用許可證：SYXK(滬)2007-0005]，均為雄性，8～12周齡，體質(zhì)量21～26g。購買后標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，每天交替進(jìn)行12h光照、12h黑暗。

3.藥品與試劑：厄貝沙坦(批號：CAS138402-11-6)購自青島捷世康生物科技有限公司；脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒(批號：S0131)、Cu,Zn-SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)(批號：S0103)、CAT活性檢測試劑盒(批號：S0051)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(批號：A0216)和彩色預(yù)染蛋白marker(批號：P0068)均購自上海碧云天公司；anti-Cu,Zn-SOD(批號：ab13498)、anti-CAT(批號：ab-16731)和anti-β-actin(批號：ab8227)均購自英國Abcam公司。

4.方法：(1) RIRI模型小鼠的制備和動物分組：雄性C57BL/6小鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成4組，即假手術(shù)組、RIRI模型組、厄貝沙坦50mg/kg組和厄貝沙坦100mg/kg組，每組10只。后3組制備RIRI模型，具體操作過程如下：2%的戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠，腹部正中線做切口，暴露雙側(cè)腎蒂，以無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂，45min后去除動脈夾，縫合切口，24h取出雙腎[10]。假手術(shù)組小鼠不夾閉雙側(cè)腎蒂，其余同RIRI模型組。厄貝沙坦組小鼠在術(shù)前24h分別按50mg/kg和100mg/kg灌胃給藥[11]，假手術(shù)組和RIRI模型組小鼠僅接受等體積0.9%氯化鈉注射液，4組均連續(xù)給藥1周。(2)血清Scr、BUN和MDA含量的測定：各組小鼠再灌24h后分別從下腔靜脈取血，血液經(jīng)離心后收集血清，全自動生化分析儀檢測血清Scr和BUN含量；按照試劑盒說明書測定血清MDA含量。(3)腎皮質(zhì)MDA含量以及Cu,Zn-SOD、CAT活力的測定：各組小鼠處死后，取出一側(cè)腎臟，切取部分皮質(zhì)進(jìn)行勻漿，按試劑盒說明書檢測腎皮質(zhì)勻漿中MDA含量以及Cu,Zn-SOD、CAT的活力。(4)腎臟病理組織學(xué)檢查：各組小鼠再灌24h后，迅速取出另一側(cè)腎臟，置于4%多聚甲醛液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片(約3μm厚)、HE染色，光鏡下觀察腎組織病理變化。(5)腎皮質(zhì)中Cu,Zn-SOD和CAT蛋白表達(dá)的檢測：每組小鼠各取5只，全部處死后取出部分腎皮質(zhì)，制備腎皮質(zhì)勻漿，按相應(yīng)比例(20mg/200μl)加入預(yù)冷的組織裂解液，充分裂解后吸取上清，提取腎皮質(zhì)總蛋白，濃度采用BCA法測定。小鼠腎皮質(zhì)中Cu,Zn-SOD和CAT蛋白水平采用Western blot法測定。取30μg總蛋白加樣于預(yù)灌制的聚丙烯酰胺凝膠中，電泳2.5h后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(PVDF)，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，洗膜后加入anti-Cu,Zn-SOD抗體及anti-CAT抗體，4℃冰箱搖床孵育過夜，洗膜后與HRP標(biāo)記的二抗混合，室溫孵育2h，采用化學(xué)發(fā)光ECL顯影、定影，選用β-actin作為內(nèi)參照，目的蛋白與β-actin的灰度比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

結(jié) 果

1.厄貝沙坦對小鼠血清中Scr、BUN和MDA含量的影響：與假手術(shù)組比較，RIRI模型組小鼠血清Scr、BUN和MDA含量均明顯升高(P<0.01)。與RIRI模型組比較，厄貝沙坦50mg/kg組和厄貝沙坦100mg/kg組的Scr、BUN和MDA含量均明顯降低(P<0.05)，且厄貝沙坦100mg/kg組小鼠血清中Scr、BUN和MDA含量明顯低于厄貝沙坦50mg/kg組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 厄貝沙坦對小鼠血清中Scr、BUN和MDA含量的影響

與假手術(shù)組比較,*P<0.01；與RIRI模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與厄貝沙坦50mg/kg組比較,ΔP<0.05

2.厄貝沙坦對小鼠腎皮質(zhì)中MDA含量以及Cu,Zn-SOD、CAT活力的影響：與假手術(shù)組比較，RIRI模型組小鼠腎皮質(zhì)中MDA含量明顯升高(P<0.01)，Cu,Zn-SOD和CAT活力均明顯下降(P<0.01)。與RIRI模型組比較，厄貝沙坦50mg/kg組和厄貝沙坦100mg/kg組小鼠腎皮質(zhì)中MDA含量均明顯降低(P<0.05)，Cu,Zn-SOD和CAT活力均明顯升高(P<0.05)，且厄貝沙坦100mg/kg組小鼠腎皮質(zhì)中MDA含量明顯低于厄貝沙坦50mg/kg組(P<0.05)，Cu,Zn-SOD和CAT活力明顯高于厄貝沙坦50mg/kg組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 厄貝沙坦對小鼠腎皮質(zhì)中MDA含量以及Cu,Zn-SOD和CAT活力的影響

與假手術(shù)組比較,*P<0.01；與RIRI模型組比較,#P<0.05，##P<0.01；與厄貝沙坦50mg/kg組比較,ΔP<0.05

3.腎臟病理組織學(xué)改變：光鏡下假手術(shù)組小鼠腎組織切片中腎小管上皮細(xì)胞無明顯腫脹，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；RIRI模型組小鼠腎小管上皮細(xì)胞腫脹明顯，可見不同程度的壞死、脫落，間質(zhì)充血與炎性細(xì)胞浸潤。厄貝沙坦50mg/kg組和厄貝沙坦100mg/kg組小鼠腎組織病理性損傷有不同程度緩解，以厄貝沙坦100mg/kg組更為明顯。各組小鼠腎臟病理性變化見圖1。

圖1 各組小鼠腎臟組織切片HE染色圖(×200)
A.假手術(shù)組；B.RIRI模型組；C.厄貝沙坦50mg/kg組；D.厄貝沙坦100mg/kg組;白色箭頭代表腎小管上皮細(xì)胞脫落；綠色箭頭代表腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤

4.腎皮質(zhì)中Cu，Zn-SOD和CAT蛋白水平：與假手術(shù)組比較，RIRI模型組小鼠腎皮質(zhì)中Cu，Zn-SOD和CAT蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)；與RIRI模型組比較，厄貝沙坦50mg/kg組和厄貝沙坦100mg/kg組小鼠腎皮質(zhì)中Cu，Zn-SOD和CAT蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，且厄貝沙坦厄貝沙坦100mg/kg組較50mg/kg組兩蛋白表達(dá)更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組小鼠腎皮質(zhì)中Cu，Zn-SOD和CAT蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2。

討 論

缺血再灌注損傷可出現(xiàn)在多種臟器中，其中RIRI在臨床上十分常見，可使移植腎功能恢復(fù)延遲、腎功能惡化，嚴(yán)重者出現(xiàn)多臟器衰竭，甚至導(dǎo)致患者死亡。其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，研究表明，與腎內(nèi)ROS水平堆積等因素密切相關(guān)[9]。因此，減少腎臟內(nèi)ROS的水平有望減輕RIRI。厄貝沙坦是繼氯沙坦之后的又一種新型長效的AT拮抗劑，有臨床資料報(bào)道，厄貝沙坦對急性腎損傷患者具有很好的療效，減少了患者外周血中炎性介質(zhì)的水平，減輕了炎癥損傷[11,12]。最新的研究發(fā)現(xiàn)其可抗脂質(zhì)過氧化和清除ROS，可對抗ROS對機(jī)體組織、細(xì)胞的損傷，對重要臟器缺血再灌注損傷具有確切的保護(hù)作用[3,6～8]。

腎臟血流量大，氧供豐富，ROS產(chǎn)生的機(jī)會較多，是體內(nèi)最容易發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的臟器之一。研究發(fā)現(xiàn)指標(biāo)MDA在一定程度上能夠反映RIRI模型小鼠氧化應(yīng)激損傷，且損傷程度的高低與腎功能指標(biāo)Scr和BUN等密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，RIRI時(shí)Scr、BUN和MDA含量均明顯升高，進(jìn)一步支持了上述觀點(diǎn)。RIRI過程中產(chǎn)生大量ROS，主要包括超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)，同時(shí)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)功能受損，特別是體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性降低，不能有效清除ROS，導(dǎo)致ROS大量堆積。堆積的ROS能夠破壞細(xì)胞膜的生物結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞功能和能量障礙進(jìn)而引起一系列病理變化[14～16]。本研究結(jié)果中同樣發(fā)現(xiàn)上述抗氧化酶Cu，Zn-SOD和CAT活性降低，提示模型制備成功，且厄貝沙坦預(yù)處理后能夠減少RIRI血清和腎皮質(zhì)中MDA含量，減輕腎臟病理性損傷，并提高腎皮質(zhì)Cu，Zn-SOD和CAT活性。Wang等[17]在RIRI大鼠模型的肝、腎組織中檢測出SOD活性均降低，而薛芳等[18]發(fā)現(xiàn)RIRI時(shí)肺組織中Cu，Zn-SOD蛋白表達(dá)均升高，機(jī)體通過上調(diào)Cu，Zn-SOD的含量來清除過多ROS，進(jìn)而保護(hù)肺組織免遭過氧化損傷。與此不一致的是，本實(shí)驗(yàn)中腎皮質(zhì)中Cu，Zn-SOD和CAT的蛋白表達(dá)均下降，考慮可能與被檢測的組織不同有關(guān)。厄貝沙坦預(yù)處理后腎皮質(zhì)中Cu,Zn-SOD和CAT的蛋白表達(dá)均升高。以上結(jié)果表明厄貝沙坦預(yù)處理能夠減少ROS堆積，提高腎組織抗氧化防御系統(tǒng)功能，減輕腎臟病理性損傷，最終減輕RIRI。

綜上所述，厄貝沙坦預(yù)處理對小鼠RIRI有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與對抗氧化應(yīng)激損傷、提高抗氧化防御系統(tǒng)功能有關(guān)，但由于厄貝沙坦的作用廣泛，而RIRI病理機(jī)制復(fù)雜，厄貝沙坦抗RIRI的其他機(jī)制有待進(jìn)一步研究。