張 洪 朱 雪 王 帥 李 菁 馬大龍 張曉平

?？崎艑僦参锏毓?Ficus tikoua Bur.)為多年生匍匐木質落葉藤本，又名地石榴、地瓜藤、地枇杷等，全株有白色的乳汁，主要分布于我國云南、貴州、廣西、湖北、甘肅等地。藤莖入藥為地板藤，始載于《滇南本草》，其味苦，性寒，有清熱利濕、活血通絡、解毒消腫之療效，主治小兒消化不良、急性胃腸炎、痢疾、黃疸、風濕痹痛、帶下、跌打損傷，是彝、苗、壯、傣、哈尼等民族廣泛使用的民族藥，資源豐富，藥用價值高[1,2]。本品《中國藥典》2015版未收載，《云南省中藥材標準(第1冊2005版)》有收載。地板藤主要含有黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類、有機酸類等化合物[3～9]。

本試驗在前期研究的基礎上，以乙醇為提取溶劑，以提取溫度、提取時間、乙醇濃度、料液比為考察因素進行單因素試驗，采用Box-Benhnken響應面法優(yōu)化地板藤總黃酮的提取工藝并探究最優(yōu)提取條件下地板藤總黃酮的抗病毒作用，為地板藤藥材的進一步開發(fā)提供理論基礎[10～16]。

材料與方法

1.材料：地板藤藥材(云南省昆明市新螺螄灣中藥材國際商貿城，批號：20160523)經云南中醫(yī)學院藥用植物學楊耀文教授鑒定為?？浦参锏毓鸉icus tikoua Bur.的干燥藤莖(粉碎，過40目篩，備用)；腸道病毒71型(EV71)；橫紋肌瘤細胞(RD)； NaNO2(上海滬試化工有限公司,批號20150708)；Al(NO3)3(天津市大茂化學試劑廠,批號20160103)；NaOH(上海滬試化工有限公司,批號20171110)；培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號8118120)；PBS磷酸鹽緩沖液(美國Gibco公司，批號8116531)；MTT(美國VWR LifeScience公司，批號1636C097)；0.25%Trypsin-EDTA(美國Gibco公司，批號1869505)。

2.儀器：酶標儀(Epoch 2微孔板分光光度計，美國Bio Tek公司)；離心機(TDD5M臺式多管自動平衡離心機)；水浴加熱鍋(DZKW-S-6型，北京永光明醫(yī)療儀器廠)；4℃冰箱(BCD-278TAJ型，海爾公司產品)；-80℃冰箱(DW-86L286型，海爾公司產品)。

3.醇提法提取地板藤總黃酮：精確稱藥材粉末5g，乙醇回流提取后，濃縮，乙醇溶液定容于100ml容量瓶中，搖勻待用。

4.蘆丁標準曲線的制備：精密量取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6ml，分別置于25ml量瓶中，各加30%乙醇至6.0ml，加5%NaNO2溶液1ml，混勻，靜置6min，加10%Al(NO3)3溶液1ml，搖勻，靜置6min，加NaOH試液10ml，再加30%乙醇至刻度，搖勻，靜置15min，以相應試劑為空白，在500nm紫外波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

6.Box-Benhnken響應面法優(yōu)化地板藤總黃酮提取工藝：使用依據Box-Benhnken中心組合設計原理，在單因素試驗的基礎上進行3因素3水平的響應面分析試驗，選取影響地板藤總黃酮得率較大的3個因素(料液比、提取時間、乙醇濃度)為自變量，以總黃酮得率(%)為響應值，采用 Design-Expert V11.1.0.1軟件對數據進行多項式擬合回歸，進一步進行響應面優(yōu)化設計。

7.病毒的準備：取200μl EV71病毒毒株接種至長成的單層RD細胞上，吸附30min后，加入10ml 2% DMEM維持液后，在37℃、5%CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時設置細胞對照，當90%以上的細胞出現(xiàn)病變時，反復凍融3次，并吹打離心(1000r/min，20min)，定量分裝上清液，待用。

9.Reed-Meuench公式法計算藥物毒性：將試驗藥物用2%DMEM維持也稀釋10個濃度梯度，接種于已經長成單層的RD細胞的96孔板中，設4個復孔、細胞對照孔和空白對照孔，置37℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，倒置顯微鏡逐日觀察，當細胞出現(xiàn)90%以上病變時終止培養(yǎng)，吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去孔內上清液。每孔加入150μl二甲基亞砜，待沉淀結晶完全溶解后，酶標儀490nm波長下檢測吸光度A值，計算TC50。TC50=[Antilog (log高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距)]×C。

10.MTT法進行地板藤總黃酮抗病毒試驗：在已長成單層的RD細胞中自無毒濃度起每孔加入100ml供試品，供試品用2% DMEM培養(yǎng)液二倍比系列稀釋并設置10個濃度梯度，每孔再加入100μl 100倍TCID50的病毒液，同時設病毒對照組及空白細胞對照組，每組4個復孔，置37℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，48h后終止培養(yǎng)，吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去孔內上清液。每孔加入150μl二甲基亞砜，待沉淀結晶完全溶解后，酶標儀490nm波長下檢測吸光度A值，計算藥物半數有效濃度(EC50)和治療指數(TI)。EC50=[Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值-比距)]×C;治療指數(TI)=半數毒性濃度(TC50)/半數有效濃度(EC50)。

結 果

1.單因素考察試驗結果：在單因素試驗中，對于提取時間的單因素試驗結果見圖1，當提取時間為0.5h時，地板藤中總黃酮得率為0.3405mg/ml，當提取時間達到1.0h時總黃酮得率達到最大，為0.3507mg/ml，0.5～1.0h，地板藤中總黃酮得率隨著提取時間的增長而逐漸增大；當提取時間達到1.5h，總黃酮得率最低，為0.2518mg/ml，之后隨時間延長增加至0.2950mg/ml，但得率整體下降。因此，選擇0.5、1.0、1.5h 3個提取時間水平進行優(yōu)化。對于乙醇濃度的單因素試驗結果見圖2，當乙醇濃度為40%～60%，隨著乙醇濃度的增加地板藤中總黃酮得率自0.2452mg/ml逐漸增大；當乙醇濃度為60%時總黃酮得率最大，為0.3333mg/ml；乙醇濃度大于60%后，總黃酮得率隨乙醇濃度增大而逐步下降至0.2933mg/ml。因此，選擇50%、60%、70% 3個乙醇濃度水平進行優(yōu)化。

圖1 提取時間對得率的影響

圖2 乙醇濃度對得率的影響

對于料液比的單因素試驗結果見圖3，隨料液比的增加地板藤中總黃酮得率由0.1994mg/ml逐漸增加至0.3517mg/ml。綜合考慮到節(jié)約人力、資源等因素，選擇1∶20、1∶30、1∶40g/ml 3個料液比水平進行優(yōu)化。對于提取溫度的單因素試驗結果見圖4，提取溫度為50℃時，地板藤中總黃酮得率最高，為0.3245mg/ml。綜合4個單因素試驗，提取溫度對總黃酮得率的影響較小，因此不對提取溫度因素進行優(yōu)化，僅選擇50℃作為提取溫度的條件使用。

圖3 料液比對得率的影響

圖4 提取溫度對得率的影響

表1 響應面實驗設計及結果

表2 方差分析

圖5 各因素交互作用對地板藤中總黃酮得率的影響

3.驗證性試驗結果：根據優(yōu)選得到的最佳工藝參數進行驗證試驗，分別稱取樣品粉末10g，各5份，測定其總黃酮得率所得率為1.1687%(RSD=0.93%，n=5)，說明該回歸方程對總黃酮得率的預測準確率高，所優(yōu)化的總黃酮工藝重復性及可操作性均較好。

4.體外抗病毒試驗結果：在病毒的毒力測定試驗中，測得TCID50值為10-4.42；在藥物的毒性測定試驗中，測得TC50值為0.789；在總黃酮的藥物毒性試驗中測得EC50值為0.084，計算得治療指數TI值為9.39。表明地板藤總黃酮在體外表現(xiàn)出了較好的抗EV71病毒作用。

討 論

響應面優(yōu)化法(RSM)是一種綜合試驗設計和數學建模的優(yōu)化方法，有著試驗精度高、次數少、數學模型預測性好等優(yōu)勢，且對試驗每個水平均可進行連續(xù)分析，克服了正交試驗只能對某一獨立點進行分析的缺點。響應面優(yōu)化法主要有Doehlert(DM)、星點設計(CCD)與Box-Behnken(BBD)3種常用的實驗設計方法。

本實驗采用Box-Behnken響應面優(yōu)化法，對地板藤總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化。首先通過單因素考察，發(fā)現(xiàn)提取溫度、提取時間、乙醇濃度、料液比4個因素對醇提總黃酮得率均有不同程度的影響，后以對總黃酮得率作用較顯著的3個因素作為優(yōu)化條件，采用響應面優(yōu)化法對提取工藝進行優(yōu)化，確定地板藤中總黃酮的最佳提取工藝條件為料液比1∶40，提取時間1.5h，乙醇濃度55.4249%，此時總黃酮得率最高，達到1.169%，該提取方法經濟可行，可進一步開發(fā)用于工業(yè)化生產。地板藤總黃酮表現(xiàn)出較好的抗EV71病毒效果，后續(xù)加強研究地板藤中總黃酮對其他病毒的抑制作用并進一步分離純化，以期找到其發(fā)揮作用的主要有效成分，為地板藤資源的開發(fā)利用奠定良好的基礎。

(致謝：本研究在山東中醫(yī)藥大學創(chuàng)新訓練平臺上完成，項目號2018057，特此感謝)