李文強(qiáng)，孫瑞芳，謝穎光，馬金孌，周素梅

(濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東濟(jì)寧272100)

心肌細(xì)胞功能的維持需要較多的能量，缺血導(dǎo)致的心肌細(xì)胞缺糖、缺氧容易造成心肌細(xì)胞凋亡和壞死[1]。大量證據(jù)表明，心臟缺血再灌注后，心肌細(xì)胞的損傷更加嚴(yán)重，這種現(xiàn)象稱為心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷[2,3]。近年來，一些研究表明黃酮類物質(zhì)能夠保護(hù)心肌細(xì)胞對抗缺血再灌注損傷[4]。黃酮類物質(zhì)是由含酚羥基的苯環(huán)(A-與B-環(huán))通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一大類化合物。槲皮黃酮是一種天然存在的黃酮類物質(zhì)，廣泛存在于中草藥和一些蔬菜當(dāng)中。β-萘黃酮是一種人工合成的黃酮類物質(zhì)。黃酮類物質(zhì)因其抗細(xì)胞凋亡、抗氧化及抗炎作用，近年來引起了廣泛關(guān)注[5,6]。2017年6月～2018年12月，本研究觀察了槲皮黃酮和β-萘黃酮對大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞調(diào)亡、壞死的影響，并對兩種黃酮的作用進(jìn)行初步比較。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞 大鼠心肌細(xì)胞系H9c2購于美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)中心，接種于DMEM培養(yǎng)基中，加入10%經(jīng)無菌滅活處理過的進(jìn)口胎牛血清，將培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 心肌細(xì)胞缺血再灌注模型制作及黃酮用法 將細(xì)胞分為黃酮1組、黃酮2組、模型組、對照組。黃酮1、2組和模型組參照文獻(xiàn)[7,8]方法構(gòu)建心肌細(xì)胞缺血再灌注模型即糖氧剝奪再恢復(fù)(OGD/R)模型：當(dāng)H9c2細(xì)胞生長融合至70%～80%時，將細(xì)胞培養(yǎng)基換為DMEM無糖培養(yǎng)基，并放置于低氧培養(yǎng)箱中(氧濃度為0.5%)，創(chuàng)造細(xì)胞氧糖剝奪的環(huán)境，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h；將細(xì)胞從低氧培養(yǎng)箱里取出，恢復(fù)正常氧濃度，同時換為DMEM正常培養(yǎng)基，在此環(huán)境下，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。黃酮1組造模前向培養(yǎng)基中加入5 μmol/L的槲皮黃酮，黃酮2組加入10 μmol/L的β-萘黃酮。模型組只制作模型，不添加特殊藥物。對照組細(xì)胞在正常氧濃度下、DMEM正常培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 凋亡細(xì)胞檢測 造模結(jié)束后使用Annexin V/PI對各組心肌細(xì)胞進(jìn)行雙染，ModFit LT軟件分析，采用雙激光流式細(xì)胞儀測算細(xì)胞凋亡率。

1.4 細(xì)胞中Caspase-3檢測 造模結(jié)束后采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞中裂解的Caspase-3蛋白：提取細(xì)胞總蛋白，用二尖酸法對蛋白進(jìn)行量化，提取的蛋白用10%～15%的SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到硝基膜(EMD)微孔；用TBS-T緩沖液配制的5%脫脂奶粉封閉3 h，或在4 ℃冰箱里封閉過夜；將膜條按順序放置于孵育一抗的盒子中，加入約1 mL抗Caspase；向抗體孵育盒子的加樣槽中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗IgG二抗，孵育2 h。釆用光密度分析儀測定膠片上條帶的平均光密度(IOD)值。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白IOD值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞壞死情況觀察 造模結(jié)束后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基，注入到96孔板中，然后加入乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒中的NAD+/INT/diaphorase配制成的混合液，在室溫下孵育30 min，最后用酶標(biāo)儀檢測96孔板中490 nm波長處的吸光度值表示LDH水平。以培養(yǎng)基中LDH水平反映細(xì)胞壞死情況。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率比較 黃酮1組、黃酮2組、模型組、對照組細(xì)胞凋亡率分別為11.02%±1.13%、12.75%±1.35%、23.49%±2.14%、9.38%±0.56%。黃酮1組、黃酮2組、模型組細(xì)胞凋亡率均高于對照組，黃酮1、2組細(xì)胞凋亡率低于模型組(P均<0.05)。兩個黃酮組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

注：1為對照組；2為模型組；3為黃酮1組；4為黃酮2組。

圖1 各組細(xì)胞凋亡情況

2.2 各組細(xì)胞中裂解的Caspase-3表達(dá)比較 黃酮1組、黃酮2組、模型組、對照組細(xì)胞中裂解的Caspase-3相對表達(dá)量分別為0.062±0.017、0.066±0.016、0.126±0.03、0.057±0.015。黃酮1組、黃酮2組、模型組細(xì)胞中裂解的Caspase-3相對表達(dá)量均高于對照組，黃酮1、2組細(xì)胞中裂解的Caspase-3相對表達(dá)量低于模型組(P均<0.05)。兩個黃酮組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

注：1為對照組；2為模型組；3為黃酮1組；4為黃酮2組。

圖2 各組細(xì)胞中裂解的Caspase-3表達(dá)

2.3 各組細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平比較 黃酮1組、黃酮2組、模型組、對照組細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平分別為(1.82±0.20)、(2.02±0.22)、(7.49±0.54)、(1.24±0.16)μU/mL。黃酮1組、黃酮2組、模型組細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平高于對照組，黃酮1、2組細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平低于模型組(P均<0.05)。兩個黃酮組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

天然黃酮類化合物雖然廣泛存在于自然界中，但因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、水溶性差、生物利用度不高、不易提煉等特點限制了其廣泛應(yīng)用。因此，以黃酮類化合物為基礎(chǔ)，對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化，引入具有不同作用的功能基團(tuán)，以期研發(fā)一批具有更強(qiáng)藥理作用的黃酮類新藥，是該研究領(lǐng)域的一個重要課題。

近年來，黃酮類化合物因其抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用而備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)天然槲皮黃酮能夠抑制缺血再灌注導(dǎo)致的自由基產(chǎn)生，進(jìn)而抑制缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。也有證據(jù)表明，人工合成β-萘黃酮通過激活抗氧化酶發(fā)揮抗氧化作用，從而防止心肌細(xì)胞損傷[9]。目前對于槲皮黃酮在抗氧化、抗凋亡和保護(hù)心肌細(xì)胞方面的研究較多，而對于β-萘黃酮抗氧化、抗凋亡方面的研究較少。本研究選取天然槲皮黃酮和人工合成β-萘黃酮，探討兩者對缺血再灌注心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，并對兩者保護(hù)心肌的作用進(jìn)行初步比較，為將來藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。研究顯示，5 μmol/L槲皮黃酮、10 μmol/L β-萘黃酮與其各自更高的濃度相比，抗氧化和抗凋亡能力無明顯差異[10]。故本研究中選擇5 μmol/L的槲皮黃酮和10 μmol/L的β-萘黃酮進(jìn)行實驗。

缺血再灌注后的心肌細(xì)胞受到更加嚴(yán)重的損傷，大量的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，甚至壞死。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注的心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，這也說明缺血再灌注對心肌細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。導(dǎo)致這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是心肌細(xì)胞在缺血再灌注后，細(xì)胞中產(chǎn)生了大量的自由基，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能破壞[11,12]；自由基還能激活細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞凋亡信號分子，最終能夠激活Caspase-3，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[13,14]。本研究中黃酮1、2組細(xì)胞凋亡率低于模型組，提示黃酮可通過減少細(xì)胞凋亡從而減輕心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷。

Caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中起著非常重要的作用，它是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行分子，細(xì)胞內(nèi)多種凋亡信號最后均通過激活Caspase-3，由Caspase-3行使細(xì)胞凋亡功能[15]。正常情況下Caspase-3以酶原的形式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)?shù)蛲鲂盘柤せ頒aspase-3，它被分解為兩個大亞基和兩個小亞基，從而使Caspase-3活化。因此檢測細(xì)胞中裂解的Caspase-3可以反映細(xì)胞中Caspase-3活化情況，進(jìn)而了解細(xì)胞是否開始凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注的心肌細(xì)胞中裂解的Caspase-3表達(dá)水平明顯升高，而給予5 μmol/L槲皮黃酮或10 μmol/L β-萘黃酮干預(yù)后裂解的Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低，同時減少了細(xì)胞凋亡，與相關(guān)研究[17，18]結(jié)果一致，提示槲皮黃酮或β-萘黃酮的抗凋亡機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

LDH存在于活細(xì)胞內(nèi)，而細(xì)胞壞死會造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的LDH釋放到培養(yǎng)液里。因此，LDH被看做細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，測定培養(yǎng)基中LDH濃度可以用來評估細(xì)胞的壞死情況[19]。本實驗結(jié)果顯示，缺血再灌注心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平顯著上升，這表明心肌細(xì)胞壞死顯著增加。加入5 μmol/L槲皮黃酮或10 μmol/L β-萘黃酮干預(yù)后培養(yǎng)基中LDH水平降低，提示槲皮黃酮和β-萘黃酮均能抑制OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，槲皮黃酮和β-萘黃酮均可減少缺血再灌注心肌細(xì)胞的凋亡和壞死。本研究中，黃酮1組與黃酮2組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞中裂解的Caspase-3相對表達(dá)量及細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這表明在保護(hù)心肌細(xì)胞方面，人工合成的β-萘黃酮與天然的槲皮黃酮作用相仿。筆者認(rèn)為這可能與兩藥的濃度選擇有關(guān)，也可能β-萘黃酮的藥理作用優(yōu)勢并不在抑制細(xì)胞凋亡和減輕細(xì)胞壞死方面。在下一步的實驗中，我們將對黃酮類化合物的作用機(jī)制和劑量進(jìn)一步探討。