劉志朝，楊佳，王莉，強(qiáng)梅

(山西醫(yī)科大學(xué)，太原030001)

遺傳印記又稱(chēng)基因組印記，是指子代中特定基因、基因簇僅表達(dá)父源或母源的等位基因，而另一側(cè)親本等位基因沉默的可遺傳表觀修飾現(xiàn)象[1]。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控等。DNA甲基化與男性不育、胚胎發(fā)育的關(guān)系已成為生殖與發(fā)育領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。有學(xué)者[2]發(fā)現(xiàn)，精子DNA全基因組高甲基化組的配偶受孕率明顯高于低甲基化組。H19為位于人染色體11p15.5的父系印記基因，大量研究表明精子H19基因低甲基化與男性不育有關(guān)[3]。Peg3是位于人染色體19q13.4、小鼠7號(hào)染色體近端的母系印記基因。Meg3是位于人染色體14q32.3、小鼠12號(hào)染色體遠(yuǎn)端的父系印記基因。敲除印記基因Peg3或Meg3的小鼠出現(xiàn)胚胎生長(zhǎng)受限或死亡[4,5]，Peg3、Meg3甲基化可能與胚胎發(fā)育有關(guān)。有研究認(rèn)為，在成熟精子中，與胚胎生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的基因啟動(dòng)子甲基化水平低，而DNA甲基化異常會(huì)導(dǎo)致胚胎異常發(fā)育和生長(zhǎng)[6]。但多數(shù)相關(guān)研究受樣本量較少限制，不易對(duì)混雜因素予以控制。因此，筆者開(kāi)展了較大樣本量研究，觀察不同年齡、BMI、吸煙和飲酒狀況等一般人口學(xué)特征的男性精子H19、Peg3、Meg3基因甲基化水平的分布情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年3～4月和2016年3～4月于山西省婦幼保健院生殖中心男科進(jìn)行孕前檢查的已婚男性(年齡22～60歲)納入研究。排除家族有遺傳病史、不育史者，精液過(guò)少者(<0.5 mL)。所有參與研究人員均簽署知情同意書(shū)。自行設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)式問(wèn)卷，內(nèi)容包括人口學(xué)特征、生活習(xí)慣、既往病史和心理健康狀況等，由培訓(xùn)合格的調(diào)查員進(jìn)行面對(duì)面調(diào)查。其中吸煙為平均每日吸煙1支或以上，持續(xù)1年以上；飲酒為平均每周至少飲酒1次，每次100 g或以上，持續(xù)1年以上。共有702人配合填寫(xiě)問(wèn)卷，其中605人提供精液樣本，共成功獲得440人的DNA甲基化檢測(cè)結(jié)果。440人中，年齡22～58歲，<30歲192人(43.6%)、30～34歲167人(38.0%)、35～39歲53人(12.0%)、>39歲26人(5.9%)；BMI 17.1～38.4，<18.5(體質(zhì)量偏低)12人(3.4%)、18.5～23.9(正常)168人(38.2%)、24.0～27.9(超重)152人(34.5%)、≥28(肥胖)104人(23.6%)；吸煙233人(53%)、不吸煙203人(46.1%)、缺失4人；飲酒128人(29.1%)、不飲酒308人(70%)、缺失4人。缺失為問(wèn)卷資料填寫(xiě)不完整。問(wèn)卷各項(xiàng)目缺失情況不重疊。

1.2 精子DNA甲基化水平檢測(cè)

1.2.1 精子DNA提取 研究對(duì)象禁欲3～7 d，手淫法收集全程精液，-80 ℃保存。用胍硫氰酸鹽沉淀法提取精子DNA。于1.5 mL的EP管中加入樣品200 μL和PBS緩沖液1 000 μL，混勻后1 500 g冷凍離心10 min，共清洗3次，以清除細(xì)胞外的物質(zhì)；棄上清，加裂解液500 μL，55 ℃水浴12 h；取出水浴的EP管，冷卻至室溫，加RNA酶10 μL，混勻，室溫孵育10 min；加等體積異丙醇，顛倒10次，16 000 g離心10 min；棄上清，加75%乙醇800 μL于EP管中，顛倒10次，16 000 g離心10 min，放置于-20 ℃數(shù)小時(shí)；再清洗1次后棄上清，待乙醇自然揮發(fā)干；加E5 30 μL于EP管中，65 ℃水浴2 h使DNA充分溶解。檢測(cè)DNA濃度和純度，取濃度大于50 ng/μL、A260/A2801.7～2.0的DNA樣本。

1.2.2 DNA的亞硫酸氫鹽修飾 使用EZ Methylation Gold-Kit試劑盒，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。在20 μL的DNA提取液(1 000 ng DNA)中加入130 μL的CT轉(zhuǎn)換試劑，放置于PCR儀上，進(jìn)行加熱變性；冷卻后將其添加至含有600 μL M-Binding Buffer的Zymo-SpinTM柱子中，10 000 g離心30 s；柱子中加入100 μL的M-Wash Buffer清洗，10 000 g離心30 s；加入200 μL的M-Desulphonation Buffer，室溫孵育15 min，10 000 g離心30 s；加入200 μL的M-Wash Buffer，10 000 g離心30 s，清洗2次；分2次共加入15 μL的M-Elution Buffer，10 000 g離心30 s，以洗脫附著在柱子膜上的DNA。取濃度>30 ng/μL、A260/A280>1.9的DNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 H19、Peg3、Meg3基因甲基化水平檢測(cè) 用PyroMark PCR Kit試劑盒對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；再經(jīng)單鏈PCR產(chǎn)物純化、測(cè)序引物雜交等步驟后使用PSQ96焦磷酸測(cè)序儀及PyroMark Gold Q96 Kit試劑盒對(duì)H19、Peg3、Meg3基因的目的片段進(jìn)行甲基化水平的檢測(cè)。測(cè)序過(guò)程參考文獻(xiàn)[7]。每個(gè)基因甲基化差異區(qū)(DMR)分析的CpGs位點(diǎn)數(shù)目∶H19基因7個(gè)，Meg3基因8個(gè)，Peg3基因7個(gè)。PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 H19、Meg3、Peg3基因的DMR區(qū)正向、反向引物及測(cè)序引物序列(5′→3′)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用K-S檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，除H19基因的CpG3位點(diǎn)數(shù)據(jù)外(P=0.2)，其余各印記基因位點(diǎn)數(shù)據(jù)均不服從正態(tài)分布(P<0.05)，因此以中位數(shù)描述數(shù)據(jù)。不同年齡、BMI者基因甲基化水平比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，對(duì)有差異的項(xiàng)目通過(guò)Nemenyi檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；不同吸煙、飲酒情況者基因甲基化水平比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同人口學(xué)特征者H19基因各CpG位點(diǎn)甲基化水平比較 H19基因甲基化數(shù)據(jù)缺失1例。不同年齡、BMI、飲酒情況者H19基因各CpG位點(diǎn)甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吸煙者H19基因CpG2、CpG7位點(diǎn)甲基化水平高于非吸煙者(P均<0.05)，去除極端值后差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CpG2位點(diǎn)數(shù)據(jù)去除0個(gè)，CpG7位點(diǎn)數(shù)據(jù)去除1個(gè)，P=0.043)。詳見(jiàn)表2。

表2 不同人口學(xué)特征者H19基因各CpG位點(diǎn)甲基化水平比較(%)

2.2 不同人口學(xué)特征者Peg3基因各CpG位點(diǎn)甲基化水平比較 不同年齡、BMI、吸煙情況、飲酒情況者Peg3基因各CpG位點(diǎn)甲基化水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表3。

表3 不同人口學(xué)特征者Peg3基因各CpG位點(diǎn)甲基化水平比較(%)

2.3 不同人口學(xué)特征者M(jìn)eg3基因各CpG位點(diǎn)甲基化水平比較 不同年齡、飲酒情況者M(jìn)eg3基因各CpG位點(diǎn)甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同BMI者M(jìn)eg3基因CpG8位點(diǎn)甲基化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步組間兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;其余CpG位點(diǎn)甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吸煙者M(jìn)eg3基因CpG2位點(diǎn)甲基化水平高于與非吸煙者(P=0.035)，去除7個(gè)極端值后組間比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.014)。詳見(jiàn)表4。

表4 不同人口學(xué)特征者M(jìn)eg3基因各CpG位點(diǎn)甲基化水平比較(%)

3 討論

目前精子DNA甲基化在男性不育、不良妊娠結(jié)局的表觀遺傳機(jī)制相關(guān)研究中逐漸受到重視，但類(lèi)似機(jī)制研究樣本量普遍較少，因此筆者進(jìn)行了較大樣本量研究來(lái)描述不同人口學(xué)特征男性精子印記基因甲基化的分布情況，以期為相關(guān)研究控制混雜因素提供理論基礎(chǔ)。

有學(xué)者[8]發(fā)現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)精子DNA有138個(gè)區(qū)域的甲基化水平降低，8個(gè)區(qū)域甲基化水平增高。該研究者進(jìn)一步比較47名平均年齡為20.46歲的青年男性與19名平均年齡為47.71歲的男性精子DNA 15個(gè)區(qū)域的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)組間仍有差異，因此認(rèn)為年齡與這些基因組位點(diǎn)的甲基化改變有關(guān)[8]。有學(xué)者[9]檢測(cè)了精子DNA中9個(gè)印記基因的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)其中有4個(gè)基因甲基化水平與年齡相關(guān)。但本研究并未發(fā)現(xiàn)不同年齡組精子H19、Peg3、Meg3基因DMR區(qū)域各CpG位點(diǎn)甲基化水平的差異。分析原因：本研究所涉及的精子3個(gè)印記基因的甲基化水平可能不隨年齡的增長(zhǎng)而變化；本研究高年齡組平均年齡較低(43.19歲)，可能導(dǎo)致了結(jié)果的差異。

Soubry等[10]對(duì)46例BMI正常男性和23例超重或肥胖男性精子印記基因甲基化水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)超重或肥胖組精子Meg3、NDN、SNRPN、Peg10基因甲基化水平降低；而Meg3-IG、H19基因甲基化水平升高。但另一項(xiàng)對(duì)3只肥胖小鼠和3只對(duì)照小鼠精子的研究發(fā)現(xiàn)，H19、IGF2、Meg3-IG、IGF2R、MEST、Peg3、NNAT、SNRPN基因的DMR甲基化水平?jīng)]有發(fā)生顯著改變[11]。本研究也未發(fā)現(xiàn)BMI正常、體質(zhì)量偏低、超重和肥胖男性精子H19、Peg3、Meg3基因DMR甲基化的差異。本研究的數(shù)據(jù)支持男性BMI與精子H19、Peg3、Meg3基因DMR甲基化水平無(wú)關(guān)。

有研究稱(chēng)吸煙可造成精子基因組甲基化水平升高[12]。一項(xiàng)對(duì)21名吸煙男性和57名不吸煙男性的研究發(fā)現(xiàn)，精子DNA中141個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平與吸煙有關(guān)[12]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，吸煙男性精子H19基因的CpG2、CpG7位點(diǎn)和Meg3基因的CpG2位點(diǎn)甲基化水平升高。多項(xiàng)研究表明，吸煙與男性不育有關(guān)[13]，且H19基因甲基化的改變與精液參數(shù)相關(guān)[14]。印記基因甲基化水平升高會(huì)使其表達(dá)水平降低[15]。現(xiàn)已證實(shí)腫瘤細(xì)胞中H19、Meg3高表達(dá)，胚胎發(fā)育過(guò)程中H19高表達(dá)[16]，精子生成過(guò)程中也有類(lèi)似的細(xì)胞增殖的過(guò)程。因此，結(jié)合本研究的結(jié)果，筆者推測(cè)吸煙可能導(dǎo)致精子H19、Meg3基因甲基化水平升高而降低二者的表達(dá)水平，從而降低精液質(zhì)量。

研究報(bào)道，雌鼠孕期10～18 d口服乙醇，F(xiàn)1代小鼠精子H19基因CpG島甲基化水平相比對(duì)照組降低了3%，Gtl2、Peg1、Snrpn、Peg3基因甲基化與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[17]。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，中度飲酒組H19基因第7個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平與不飲酒組、重度飲酒組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，重度飲酒組Ig-DMR甲基化水平與其他兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[18]。飲酒對(duì)精子印記基因甲基化的影響尚無(wú)定論。本研究的數(shù)據(jù)也提示，不同飲酒狀況的人群中，精子H19、Peg3、Meg3基因DMR甲基化水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)不同年齡、BMI和飲酒情況的男性精子H19、Peg3、Meg3基因甲基化水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；有吸煙習(xí)慣的男性精子H19基因的CpG2、CpG7位點(diǎn)和Meg3基因的CpG2位點(diǎn)甲基化水平高于非吸煙者。下一步將有針對(duì)性地探討不同印記基因甲基化水平的影響因素，并在可能的條件下通過(guò)隊(duì)列研究探討印記基因甲基化水平與不孕不育的關(guān)系。