張明川，張玲，馬一鳴，程淑霞，王莉

miR-199a-5p下調(diào)NF-κB信號通路激活水平抑制宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為

張明川，張玲，馬一鳴，程淑霞，王莉

450000 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科（張明川、馬一鳴、程淑霞、王莉）；839000 新疆，哈密市第二人民醫(yī)院腫瘤外科（張玲）

探討 miR-199a-5p 對宮頸癌細(xì)胞生長、侵襲和遷移的影響和機(jī)制。

Real-time PCR 測定 miR-199a-5p 在宮頸癌 HeLa、HCC94、CaSki 細(xì)胞和正常宮頸Ect1/E6E7 細(xì)胞中的表達(dá)差異。在宮頸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-199a-5p mimics，real-time PCR 檢測過表達(dá)效果，MTT 檢測增殖，克隆形成實(shí)驗(yàn)測定克隆形成能力，Transwell 小室測定侵襲和遷移能力，Western blot 檢測細(xì)胞中 p-p65、p-IκB 蛋白表達(dá)變化。使用核因子-κB（NF-κB）激活劑 PMA 處理轉(zhuǎn)染 miR-199a-5p mimics 后的宮頸癌細(xì)胞，同樣使用上述方法測定細(xì)胞生長、克隆、侵襲和遷移能力變化。

miR-199a-5p 在宮頸癌 HeLa、HCC94、CaSki 細(xì)胞中的表達(dá)水平低于正常宮頸Ect1/E6E7 細(xì)胞。miR-199a-5p mimics 提高宮頸癌細(xì)胞中 miR-199a-5p 表達(dá)水平，降低細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和遷移能力，減少細(xì)胞中 p-p65、p-IκB 蛋白表達(dá)。NF-κB 激活劑 PMA 可以逆轉(zhuǎn) miR-199a-5p 對宮頸癌細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和遷移能力的抑制作用。

miR-199a-5p 通過下調(diào) NF-κB 信號通路激活水平抑制宮頸癌細(xì)胞生長、侵襲和遷移。

宮頸腫瘤； 腫瘤侵潤； 細(xì)胞增殖； NF-κB； miR-199a-5p

宮頸癌是世界上常見的女性惡性腫瘤，宮頸癌細(xì)胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移是患者死亡的關(guān)鍵。目前對于腫瘤的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在腫瘤細(xì)胞惡性行為中具有關(guān)鍵作用[1-2]。miR-199a-5p 在腫瘤組織中異常表達(dá)，并且參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移以及增殖等過程，目前已知其在結(jié)直腸癌、卵巢癌、肝癌中表達(dá)下降，并且具有負(fù)調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性增殖的作用[3-5]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路是一個在腫瘤組織中過度激活的腫瘤調(diào)控因子，其激活后可以增加腫瘤的惡性程度[6]。之前的研究報(bào)道顯示，miR-199a-5p 可以降低卵巢癌細(xì)胞中 NF-κB 信號通路的激活水平，miR-199a-5p 表達(dá)下調(diào)后可以通過 NF-κB 信號通路誘導(dǎo)膀胱癌的發(fā)生[7]。有研究顯示，miR-199a-5p 在宮頸癌組織中低表達(dá)[8]。目前對于 miR-199a-5p 在宮頸癌細(xì)胞生長、侵襲和遷移中的作用及調(diào)控機(jī)制是否與 NF-κB 相關(guān)尚不清楚。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討 miR-199a-5p 在宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用，為靶向基因治療宮頸癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌 HeLa、HCC94、CaSki 細(xì)胞和正常宮頸 Ect1/E6E7 細(xì)胞購自上海歌凡生物細(xì)胞庫；miRNA 第一鏈合成試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；實(shí)時熒光定量 PCR 試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；p-p65 抗體、p-IκB 抗體購自美國 Santa Cruz 公司；Trizol 試劑和轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000 購自美國 Invitrogen 公司；NF-κB 激活劑 PMA 購自美國 Sigma 公司；miR-199a-5p mimics、mimics control 購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR 檢測 miR-199a-5p 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)變化 分別在宮頸癌HeLa、HCC94、CaSki 細(xì)胞和正常宮頸 Ect1/E6E7 細(xì)胞中添加 300 μl 的 Trizol 試劑，充分裂解后，常規(guī)方法提取細(xì)胞中總 RNA。吸取 1 μl 的 RNA，測定其260 nm 和 280 nm 下的光密度（），260/280的比值應(yīng)在1.8 ~ 2.0 之間，表明 RNA純度較好，符合實(shí)驗(yàn)要求。以總 RNA 作為模板，根據(jù) miRNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的 cDNA 保存在–20 ℃。以real-time PCR檢測 miR-199a-5p 表達(dá)變化。PCR 體系為：10 nmol/L 的上下游引物各 1 μl、cDNA 模板 1 μl、SYBR Premix EX Taq 10 μl，添加 7 μl 的 DEPC 水。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 3 min；60 ℃退火 40 s；72 ℃延伸 30 s，一共循環(huán) 45 次。以2-△△Ct值表示 miR-199a-5p 表達(dá)水平。內(nèi)參為 U6。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，miR-199a-5p 上游 5' GGGCCCAGTGTTCAGACTAC 3'，下游 5' GTGCAGGGTCCGAGGT 3'；U6 上游 5' CGCTTC GGCAGCACA 3'，下游 5' AACGCTTCACGAATTT GCGT 3'。

1.2.2 細(xì)胞分組 取 HeLa 細(xì)胞，用轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000 將 miR-199a-5p mimics、mimics control 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，按照轉(zhuǎn)染試劑標(biāo)準(zhǔn)流程操作。把轉(zhuǎn)染后的 HeLa 細(xì)胞分別記為 miR-199a-5p、miR-NC，把只加入轉(zhuǎn)染試劑的 HeLa 細(xì)胞記為對照。細(xì)胞在培養(yǎng) 2 d 以后，使用 real-time PCR 檢測細(xì)胞中 miR-199a-5p 表達(dá)變化，評估過表達(dá)效果。

1.2.3 CCK8 測定細(xì)胞增殖 在 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種 miR-NC、miR-199a-5p細(xì)胞，每個孔內(nèi)加入 5 × 103個細(xì)胞（細(xì)胞懸浮液體積為 100 μl）。細(xì)胞培養(yǎng) 2 d 以后，在每個孔內(nèi)添加 CCK8 工作液各 10 μl，放在 37 ℃孵育反應(yīng) 3 h 以后，測定每個孔 450 nm 的值，使用不含細(xì)胞的孔調(diào)零。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞克隆 在 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種 miR-NC、miR-199a-5p 細(xì)胞，每個孔中添加 1 × 103個細(xì)胞，每隔 2 天換液一次，培養(yǎng) 12 d 以后，用 PBS 溶液將細(xì)胞洗滌，結(jié)晶紫染色后，計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=（克隆形成數(shù)目÷ 接種細(xì)胞數(shù)目）× 100%

1.2.5 Transwell 小室測定細(xì)胞侵襲和遷移 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)均用 Transwell 小室進(jìn)行檢測，侵襲實(shí)驗(yàn)前需要用基質(zhì)膠將小室濕化，用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將 miR-NC、miR-199a-5p 細(xì)胞懸浮，在小室的上室中添加 200 μl 的細(xì)胞懸浮液，在小室的下室中添加 500 μl 的含血清培養(yǎng)液，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 d。取出小室，用棉簽把沒有穿膜的細(xì)胞擦掉，使用 0.1% 的結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇 5 個視野，計(jì)算細(xì)胞穿膜數(shù)目。

1.2.6 Western blot 檢測 p-p65、p-IκB 蛋白表達(dá) 取培養(yǎng) 2 d 后的miR-NC、miR-199a-5p 細(xì)胞，添加含有抑蛋白酶分解試劑的 RIPA 裂解溶液，混合均勻以后，放在冰上裂解 20 min。4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清溶液，蛋白存在于上清中。將蛋白同 5 × 上樣緩沖液混勻，置于 100 ℃孵育 5 min。將蛋白添加到 SDS-PAGE 凝膠上樣孔中，初始電壓設(shè)置為 80 V，分離膠中的電壓為 100 V。以恒定電流 300 mA 轉(zhuǎn)膜 70 min。取出電轉(zhuǎn)后的 PVDF 膜，置于 5% 牛血清白蛋白中封閉，然后將 PVDF 膜放在已經(jīng)稀釋好的一抗孵育液中，放在室溫中反應(yīng) 2 h。將 PVDF 膜放在 1:3000 稀釋后的二抗反應(yīng)液中，置于室溫中孵育 2 h。采用 ECL 法顯色以后，用 Image J 分析條帶的灰度值，把 GAPDH 作為內(nèi)參，分析目的蛋白表達(dá)水平。p-p65、p-IκB 抗體以 1:400 稀釋。

1.2.7 PMA 對過表達(dá) miR-199a-5p 的宮頸癌細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和遷移影響 取轉(zhuǎn)染 miR-199a-5p mimics 后的 HeLa 細(xì)胞，用含有 0、100 nmol/L 的 NF-κB 激活劑 PMA 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為 miR-199a-5p、miR-199a-5p + PMA。培養(yǎng) 2 d 后，按照 MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell 小室方法檢測細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和遷移變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-199a-5p 在宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá)

miR-199a-5p 在宮頸癌 HeLa、HCC94、CaSki 細(xì)胞中的表達(dá)水平均低于正常宮頸Ect1/E6E7 細(xì)胞（< 0.05）。HeLa 細(xì)胞中 miR-199a-5p 表達(dá)水平低于 HCC94、CaSki 細(xì)胞（< 0.05）（圖 1）。

2.2 miR-199a-5p mimics 提高宮頸癌 HeLa 細(xì)胞中 miR-199a-5p 表達(dá)水平

宮頸癌 HeLa 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-199a-5p mimics，細(xì)胞中的 miR-199a-5p 水平升高，見圖 2。miR-199a-5p mimics 提高宮頸癌 HeLa 細(xì)胞中 miR-199a-5p 表達(dá)水平。

2.3 miR-199a-5p 抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、克隆、侵襲、遷移

過表達(dá) miR-199a-5p 的宮頸癌 HeLa 細(xì)胞值和克隆形成率降低，細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目下降（表 1）。miR-199a-5p 具有抵抗宮頸癌 HeLa 細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和遷移的作用。

miR-199a-5p 相對表達(dá)Relative expression of miR-199a-5p1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Ect1/E6E7 HeLa HCC94 CaSki

Figure 1 Expression of miR-199a-5p in HeLa, HCC94, CaSki cells and normal cervical Ect1/E6E7 cells (*Compared with Ect1/E6E7,< 0.05;#Compared with HCC94 and CaSki,< 0.05)

miR-199a-5p 相對表達(dá)Relative expression of miR-199a-5p3 2 1 0 對照 miR-NC miR-199a-5p Control

Figure 2 Expression of miR-199a-5p in HeLa cells of cervical cancer before and after miR-199a-5p mimics transfection (*Compared with miR-NC,< 0.05)

表 1 miR-199a-5p mimics 轉(zhuǎn)染前后宮頸癌HeLa 細(xì)胞OD值、克隆形成率、侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目（）

注：*與miR-NC 比較，< 0.05。

Note:*Compared with miR-NC,< 0.05.

p-IκB p-p65 GAPDH 對照 miR-NC miR-199a-5p Control 蛋白水平Protein levels0.8 0.6 0.4 0.2 0對照ControlmiR-NCmiR-199a-5p A p-p65 p-IκB B

Figure 3 p-p65 and p-IκB protein levels in HeLa cells before and after miR-199a-5p mimics transfection (A: Western blot was used to detect the levels of p-p65 and p-IκB protein in HeLa cells before and after miR-199a-5p mimics transfection; B: Using GAPDH as internal reference, the levels of p-p65 and p-IκB protein were analyzed;*Compared with miR-NC,< 0.05)

2.4 過表達(dá) miR-199a-5p 降低宮頸癌細(xì)胞中 NF-κB 信號通路激活水平

過表達(dá) miR-199a-5p 的宮頸癌 HeLa 細(xì)胞中 p-p65、p-IκB 蛋白水平降低（圖 3）。表明miR-199a-5p 具有抵抗宮頸癌 HeLa 細(xì)胞中 NF-κB 信號通路激活的作用。

2.5 NF-κB 信號通路激活劑 PMA 逆轉(zhuǎn)作用

NF-κB 信號通路激活劑 PMA 處理轉(zhuǎn)染 miR-199a-5p mimics 后的宮頸癌 HeLa 細(xì)胞，細(xì)胞中的 p-p65、p-IκB 蛋白水平升高，細(xì)胞值、克隆形成率、侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目也升高。NF-κB 信號通路激活劑 PMA 可以提高過表達(dá) miR-199a-5p 的宮頸癌 HeLa 細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和遷移能力，見圖4 和表2。

miR-199a-5p miR-199a-5p + PMA p-IκB p-p65 GAPDH

Figure 4 Western blot was used to detect the effects of PMA, an activator of NF-κB signaling pathway, on p-p65 and p-IκB proteins in cervical cancer HeLa cells transfected with miR-199a-5p mimics

3 討論

miRNA 是一類具有復(fù)雜生物學(xué)作用的小分子 RNA，在生命機(jī)體分化、生長、凋亡等過程中具有多重作用[9]。miR-199a-5p 參與腫瘤進(jìn)展過程，在腫瘤惡性發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要作用[10]。目前對于miR-199a-5p 的研究顯示，miR-199a-5p 在腎細(xì)胞癌中表達(dá)缺失，上調(diào) miR-199a-5p 后的腫瘤細(xì)胞生長能力降低，腫瘤形成能力減弱，miR-199a-5p 被看作是抑制腎癌進(jìn)展的重要調(diào)控因子[11]。在肝癌中發(fā)現(xiàn) miR-199a-5p 表達(dá)下調(diào)與肝癌患者的病理分期等有關(guān)，miR-199a-5p 能夠降低肝癌細(xì)胞惡性增殖能力[5]。在結(jié)直腸癌等腫瘤中同樣發(fā)現(xiàn) miR-199a-5p 具有類似抑癌基因的作用[12]。我們的實(shí)驗(yàn)在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) miR-199a-5p 低表達(dá)，并且過表達(dá) miR-199a-5p 后的宮頸癌細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和遷移能力下降，miR-199a-5p 在宮頸癌進(jìn)展中可能發(fā)揮抑制作用，重建 miR-199a-5p 表達(dá)可能是治療宮頸癌的途徑。

實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步探討了 miR-199a-5p 的作用機(jī)制，在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-199a-5p 后的宮頸癌細(xì)胞中 p-p65、p-IκB 蛋白水平降低。p-p65、p-IκB 是 NF-κB 信號通路的調(diào)節(jié)因子，NF-κB 是存在于細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其由于能夠同 B 細(xì)胞的免疫球蛋白中的 κB 序列特異性的結(jié)合而被命名，NF-κB 能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)很多基因表達(dá)，參與炎癥、免疫反應(yīng)、腫瘤進(jìn)展、細(xì)胞發(fā)育、病毒復(fù)制等過程[13-15]。p65 是 NF-κB 的重要亞單位，其磷酸化后可以促進(jìn) NF-κB 信號激活[16]。IκB 是 NF-κB 信號激活過程中正調(diào)控因子，其被磷酸化后促進(jìn) NF-κB 信號激活[17]。實(shí)驗(yàn)提示miR-199a-5p 作用機(jī)制可能與抑制 NF-κB 信號激活有關(guān)。

表 2 NF-κB 信號通路激活劑PMA 處理miR-199a-5p mimics 轉(zhuǎn)染后宮頸癌HeLa 細(xì)胞中p-p65、p-IκB 蛋白水平及細(xì)胞OD值、克隆形成率、侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目（）

注：*與miR-199a-5p 比較，< 0.05。

Note:*Compared with miR-199a-5p,< 0.05.

目前對于 NF-κB 在腫瘤中的研究顯示，NF-κB 過度激活是誘導(dǎo)腫瘤惡性發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[18-19]。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí) NF-κB 激活劑可以逆轉(zhuǎn) miR-199a-5p 的抗宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用，這與上述NF-κB 在腫瘤中的作用相符合，同時也證明miR-199a-5p 作用機(jī)制與負(fù)調(diào)控 NF-κB 有關(guān)?，F(xiàn)階段對于 miR-199a-5p 的作用機(jī)制研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，其可以調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞中 NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，miR-199a-5p 降低細(xì)胞中 NF-κB 信號通路的激活，下調(diào) p65 的磷酸化水平[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同上述研究結(jié)果一致，在宮頸癌細(xì)胞中證實(shí)了 miR-199a-5p 作用機(jī)制與 NF-κB 有關(guān)。

綜上，miR-199a-5p 可能是宮頸癌惡性進(jìn)展的抑制因子，提高宮頸癌中 miR-199a-5p 表達(dá)水平可能是治療宮頸癌的途徑，并且其作用機(jī)制與降低 NF-κB 信號激活水平有關(guān)。目前我們的實(shí)驗(yàn)只在一株宮頸癌細(xì)胞中進(jìn)行了初步探討，后續(xù)會在多株宮頸癌細(xì)胞及體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究 miR-199a-5p 在宮頸癌中的作用和機(jī)制提供了參考，對于其具體的靶向調(diào)控作用位點(diǎn)還需進(jìn)一步探索。

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miR-199a-5p down-regulates the activation level of NF-κB signaling pathway and inhibits malignant biological behavior of cervical cancer cells

ZHANG Ming-chuan, ZHANG Ling, MA Yi-ming, CHENG Shu-xia, WANG Li

Department of Gynecologic Oncology, Cancer Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Henan Cancer Hospital, Henan 450000, China (ZHANG Ming-chuan, MA Yi-ming, CHENG Shu-xia, WANG Li); Department of Surgical Oncology, The Second People's Hospital of Hami, Xinjiang 839000, China (ZHANG Ling)

To investigate the effects and mechanisms of miR-199a-5p on the growth, invasion and migration of cervical cancer cells.

Real-time PCR was used to detect the expression of miR-199a-5p in HeLa, HCC94, CaSki cells and normal cervical Ect1/E6E7 cells. miR-199a-5p mimics were transfected into cervical cancer cells. Real-time PCR was used to detect the overexpression effect. MTT assay was used to detect proliferation and the colony formation ability was determined by clone formation test. Transwell chamber was used to measure invasion and migration ability. Western blot was used to detect the expression of p-p65 and p-IκB protein. The cervical cancer cells transfected with miR-199a-5p mimics were treated with PMA, an activator of NF-κB. The changes of cell growth, colony formation, invasion and migration ability were also measured by the above methods.

The expression level of miR-199a-5p in HeLa, HCC94 and CaSki cells was lower than that in normal cervical Ect1/E6E7 cells. miR-199a-5p mimics increased the expression of miR-199a-5p in cervical cancer cells and reduced cell proliferation, colony formation, invasion and migration, and the expression of p-p65 and p-IκB protein in cells. PMA, an activator of NF-κB, could reverse the inhibitory effect of miR-199a-5p on proliferation, colony formation, invasion and migration of cervical cancer cells.

miR-199a-5p down-regulates the activation level of NF-kB signaling pathway and inhibits the growth, invasion and migration of cervical cancer cells.

Uterine cervical neoplasms; Neoplasm invasiveness; Cell proliferation; NF-kappa B; miR-199a-5p

WANG Li, Email: 13837196622@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.007

王莉，Email：13837196622@163.com

2019-03-27