聶璐，吳奎海，陳文靜，李煒煊

插入序列IS6100介導DNA序列轉移的機制研究

聶璐，吳奎海，陳文靜，李煒煊

528000 廣東，佛山市第一人民醫(yī)院檢驗科

插入序列 IS6100 與耐藥基因轉移密切相關，本研究旨在初步探究 IS6100 轉移 DNA 序列的機制。

以 Genbank 庫中已有序列中含兩個及兩個以上拷貝 IS6100 序列的質(zhì)?；蛘呷旧w為研究對象，通過生物信息分析的方法分析各 IS6100 側翼的靶位點重復序列（TSD），推測該元件轉座酶可能的工作機制。

共檢索到 22 條序列，含 5 條染色體、16 條質(zhì)粒以及 1 條定位未知的轉座子序列。其中有 13 條序列（59%）來自鞘脂菌屬細菌，余下均來自條件致病菌的染色體或質(zhì)粒。在鞘脂菌屬細菌 TKS 中，IS6100 拷貝數(shù)可多達 29 個，且 IS6100 和鞘脂菌屬細菌基因組的 GC% 均接近 60%。共有 35 條不同的 8 bp TSD 在這些菌株中出現(xiàn)的頻率為 2 ~ 8 次。TSD 的 GC% 含量在 13% ~ 100%，有 87%（30/35）的 TSD 序列 GC% 含量均≥ 50%。這些 TSD 可同時出現(xiàn)在同一菌株的染色體或質(zhì)粒內(nèi)部、同一菌株的染色體和質(zhì)粒之間、不同菌株的染色體和質(zhì)粒間。

IS6100 的產(chǎn)生菌可能為鞘脂菌屬細菌。IS6100 的作用靶位點沒有高度選擇性，但仍傾向作用于高GC% 含量位點。兩個 IS6100 可以形成復合轉座子，轉移其間的 DNA 序列，這些轉座事件可以發(fā)生在分子間和分子內(nèi)。

DNA 轉座子； 基因轉移，水平； IS6100； 耐藥機制

耐藥基因的轉移總是與各種可轉移元件相關（mobile genomic elements，MGEs），這其中包括質(zhì)粒、復合轉座子、單元轉座子、可整合可接合元件和插入序列（insertion sequence，IS）等[1]。插入序列本身不含耐藥基因，但是它編碼一個或多個轉座酶。絕大多數(shù)插入序列末端都有反向重復序列（terminal inverted repeats，TIRs），大小為10 ~40 bp。依據(jù)TIRs 在轉座酶的上游還是下游細分為 IRL（inverted repeat left）和 IRR（inverted repeatright）。TIRs 提供了插入序列轉座酶的識別和結合位點，參與序列剪切和轉移的過程[2]。

隨著越來越多細菌基因組被解析，插入序列與耐藥基因的關系也逐漸明晰。有些耐藥基因一般位于插入序列的下游，如NDM-1（B 組碳青霉烯酶基因）一般位于 IS下游[3]，CTX-M（超廣譜 β 內(nèi)酰胺酶基因）一般位于 IS的下游，耐藥基因和插入序列一起轉移，并且耐藥基因上游的插入序列可能提供耐藥基因表達的啟動子序列[4]。有些耐藥基因位于兩個相同的插入序列形成的復合轉座子內(nèi)部，隨復合轉座子的轉座進行轉移。典型的如 Tn6020，是兩個 IS26之間定位有一個（氨基糖苷類磷酸化酶基因）[5]。目前發(fā)現(xiàn)的有 4000 多個IS 序列，分屬于 30 個 IS 家族，一般而言，同家族的插入序列成員其作用機制是類似的[6]。

IS26是 IS6家族成員，被公認為是目前為止革蘭氏陰性菌尤其腸桿菌科細菌中最為活躍的插入序列之一，其參與耐藥基因的募集、重排和流動的事實有大量基因組數(shù)據(jù)和實驗證據(jù)證實。在 2014 – 2016 年分別有 4 篇文獻報道闡明了 IS26在耐藥基因轉移中的作用和可能的機制[7-10]。文獻介紹了一個和多個拷貝 IS26如何在分子間或者分子內(nèi)介導 DNA 序列的移動，以及移動后會在 IS26兩側留下分子印記，即靶位點重復（target site duplications，TSD）。TSD 是 DDE 轉座酶催化轉座事件發(fā)生的分子標識，它的長度反映的是轉座子的特征之一[8]?；?IS26的復合轉座子介導的轉座事件經(jīng)常在兩個 IS26側翼有 5 bp 或者 8 bp 的 TSD。

IS6100也是與耐藥基因密切相關的插入序列之一，它們的共性在于 IS6100和 IS26同屬于 IS6家族成員，這兩個插入序列的TIRs 都是14 bp，且序列相似度高。但是 IS6100在其基因環(huán)境上有與 IS26相區(qū)別的特點，主要表現(xiàn)在：① IS6100經(jīng)常出現(xiàn)在In4 型 I 型整合子的末端[1]；②相比 IS26 經(jīng)常有多個拷貝出現(xiàn)在同一個菌的基因組中，形成一個或多個復合轉座子，IS6100極少有形成復合轉座子的情況，大多數(shù)都是單個出現(xiàn)在質(zhì)?；蛉旧w的耐藥基因附近。

本文以 Genbank 庫中提交的基因組數(shù)據(jù)為檢索背景，以含有兩個（一個完整一個截短）IS6100拷貝的基因組數(shù)據(jù)（質(zhì)?；蛘呷旧w）為研究對象，通過生物信息學分析手段，調(diào)查研究 IS6100側翼 8 bp 序列的特征，以期為闡明其確切的作用機制提供一些線索。

1 材料與方法

1.1 材料序列檢索及納入研究

用完整的 IS6100參考序列，長度為 880 bp（accession 號：X53635），來自 ISfinder（https:// www-is.biotoul.fr/），比對檢索 NCBI Genbank 庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），當細菌染色體或者質(zhì)粒上同時出現(xiàn)兩個拷貝的IS6100時（包含一個是完整的 IS6100，另一個截短IS6100的情況），即納入為我們的研究對象，檢索 Genbank 庫時間為 2018 年 6 月。

1.2 方法

1.2.1 生物信息分析 從 Genbank 下載上述納入研究序列的所有 Fasta 文件，導入 CLC Genomics workbench 軟件（版本號 8.5），逐條分析。記錄每個 IS6100在基因組中的位置（質(zhì)粒或者染色體），每個拷貝的方向（正向或者反向），序列起點和終點，以及每個 IS6100 兩側的 8 bp 堿基的情況。對于 IS6100為反向的情況，用在線序列轉換軟件 Reverse Complement（http://www.bioinformatics.org/ sms/rev_comp.html）將其側翼8 bp 堿基調(diào)整為正向，記錄在表格中。GC% 含量采用在線網(wǎng)站提交序列進行計算（https://www.sciencebuddies.org/）。

1.2.2 匯總分析 分析 IS6100 側翼 8 bp 序列特征，出現(xiàn)的頻率。推測 IS6100 作用的靶位點特征，分子間（質(zhì)粒與染色體之間、不同質(zhì)粒間，不同染色體間）、分子內(nèi)（同一條染色體和質(zhì)粒序列內(nèi)部）是否可能有 IS6100 介導的轉座事件發(fā)生。

2 結果

2.1 序列檢索概況

總體上講，多拷貝 IS6100出現(xiàn)在同一個菌中的情況明顯少于同家族成員 IS26。一共檢索到22 條序列，含 5 條染色體、16 條質(zhì)粒以及 1 條轉座子序列（accession No.KT897470），沒有提供具體的定位信息。檢索具體信息如 Genbank 編號、菌株名稱及序列定位信息、每條序列中出現(xiàn)的拷貝數(shù)等信息詳見表 1。這其中有 13 條序列（59%）出現(xiàn)在鞘脂菌屬（），其中含2 條鞘脂菌屬的染色體，余下 11 條為鞘脂菌屬質(zhì)粒。表 1 中質(zhì)粒 pTK1、pTK3、pTK4、pTK6 來自鞘脂菌屬細菌 TKS。質(zhì)粒 pMI1、pMI2、pMI3、pMI4 來自鞘脂菌屬細菌 MI1205。

除鞘脂菌屬外，多個拷貝的 IS6100還出現(xiàn)在一些條件致病菌中，如銅綠假單胞菌染色體、陰溝腸桿菌染色體、大腸桿菌質(zhì)粒、肺炎克雷伯桿菌質(zhì)粒、解聚乙二醇鞘氨醇盒菌質(zhì)粒和基因組中。

2.2 IS6100 的產(chǎn)生菌

IS6100首次提交 ISfinder（https://www-is. biotoul.fr/）是出現(xiàn)在偶發(fā)分枝桿菌（）中，但關于IS6100來自哪個種屬，目前尚未有定論。IS6100的 GC% 含量為 60.6%。而 Genbank 中兩條鞘脂菌屬染色體的 GC% 含量分別為63.4%（accession 號：CP005083）和 62.4%（accession 號：CP013264），略高于 IS6100，但十分接近。所以單從 GC% 含量上判定，仍無法給出明確結論。

一個非常顯著的特點是 IS6100出現(xiàn)在鞘脂菌屬染色體和質(zhì)粒上的拷貝數(shù)非常多。在表 1 所列的情況里，通過文獻檢索我們發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒 pTK1、pTK3、pTK4、pTK6 以及染色體序列（accession 號：CP005083）來自同一株鞘脂菌屬細菌 TKS，質(zhì)粒 pMI1、pMI2、pMI3、pMI4 均來自鞘脂菌屬細菌 MI1205。這樣算來，鞘脂菌 TKS 和 MI1205 里，一共分別有多達 29 和 27 個拷貝 IS6100，這種情況實屬少見。鞘脂菌屬細菌極有可能是 IS6100 的產(chǎn)生菌，但無法確定是哪個具體的種。

表 1 Genbank 庫中檢索到的 IS6100概況以及側翼 8 bp 序列分析

續(xù)表 1

注：*表示該 IS6100 拷貝與參考序列 IS6100 相比有堿基缺失或增加，導致 IS6100 全長不是 880 bp；Δ表示該 IS6100 拷貝有截短，不是完整拷貝；a ~ z，aa ~ ai 標注的是在這些質(zhì)粒和染色體序列中出現(xiàn)次數(shù)大于 2 次的 8 bp 側翼序列，一共有 35 種情況；#表示目前該種屬沒有合適的中文名稱。

Notes:*Indicates that the IS6100 copy has base deletion or increase compared with the reference IS6100 sequence, resulting in the length of IS6100 is not 880 bp;ΔIndicates that IS6100 copy has been truncated, not full copy; a - z, aa - ai labeled was the 8 bp flanking sequence that appeared more than 2 times in these plasmids and chromosome sequences, with a total of 35 situations;#Indicates that there is no suitable Chinese name for this species.

表 2 IS6100 作用的靶位點序列特征

2.3 象征轉座事件發(fā)生的 8 bp TSD 分析

每個 IS6100 末端 8 bp 的序列見表 1。我們發(fā)現(xiàn)重復出現(xiàn) 2 次及以上的 8 bp 序列一共有35 種不同情況，說明 IS6100 對其作用的靶位點并沒有高度選擇性，但這 35 種情況中僅有 5 種是GC% 含量低于 50%，說明 IS6100選擇作用的靶點具備高 GC% 含量的特征。對這些重復出現(xiàn)的8 bp 序列在表 1 中進行標注，相同的序列標示同樣的顏色，并在右上角標注同樣的字母。表 2 統(tǒng)計了每種重復出現(xiàn) TSD 的頻次和 GC% 含量。

8 bp TSD 出現(xiàn)的情況一共有如下幾種：①僅出現(xiàn)在同一株菌的染色體序列中，比如 a：CCA CTTTG，d：GGGCGGGC 等；②僅出現(xiàn)在同一株菌的質(zhì)粒中，比如 f：TCATAGAT，g：GGCCTGCG 等；③同一菌株染色體內(nèi)部，不同菌株染色體和質(zhì)粒間，同一菌株的不同質(zhì)粒間，比如 b：GCAG CGCG；④不同菌株的質(zhì)粒間和同一質(zhì)粒內(nèi)部，比如 j：CGCGCGCC；⑤不同菌株的質(zhì)粒間、同一質(zhì)粒內(nèi)部、同一菌株質(zhì)粒間，比如i：AAAAATGT；⑥不同菌株染色體和質(zhì)粒間，比如ab：CTCGTG TG。這些證據(jù)都強烈地提示 IS6100參與了基因序列在同一菌株染色體內(nèi)部、質(zhì)粒內(nèi)部和不同菌株染色體間、質(zhì)粒間的交換，并留下了轉座事件發(fā)生的分子印跡。

3 結論

基于 IS6100在鞘脂菌屬細菌基因組中有多達 29 個拷貝以及 IS6100 和鞘脂菌屬細菌 GC% 接近的事實，可以推測 IS6100 可能來源于該屬的細菌，但具體的種仍不明確。IS6100 識別的靶位點大多具有高 GC% 含量。IS6100 可以介導不同細菌染色體間、質(zhì)粒間、同一個細菌內(nèi)部染色體和質(zhì)粒間以及同一序列內(nèi)部的序列轉移，并且是通過 DDE 轉座酶介導，留下轉座事件發(fā)生的分子標識，即 8 bp 靶位點重復序列。詳細的 IS6100 介導上述 22 條序列中哪些 DNA 序列的募集、重排和流動，需要進一步詳盡地解析本文中提到的染色體和質(zhì)粒序列。

[1] Partridge SR, Kwong SM, Firth N, et al. Mobile genetic elements associated with antimicrobial resistance. Clin Microbiol Rev, 2018, 31(4):e00088-17.

[2] Lee H, Doak TG, Popodi E, et al. Insertion sequence-caused large-scale rearrangements in the genome of Escherichia coli. Nucleic Acids Res, 2016, 44(15):7109-7119.

[3] Chatterjee S, Datta S, Roy S, et al. Carbapenem resistance in acinetobacter baumannii and other acinetobacter spp. causing neonatal sepsis: focus on NDM-1 and its linkage to ISAba125. Front Microbiol, 2016, 7:1126.

[4] Wang Y, Song C, Duan G, et al. Transposition of ISEcp1 modulates blaCTX-M-55-mediated Shigella flexneri resistance to cefalothin. Int J Antimicrob Agents, 2013, 42(6):507-512.

[5] Blackwell GA, Hamidian M, Hall RM. IncM plasmid R1215 is the source of chromosomally located regions containing multiple antibiotic resistance genes in the globally disseminated acinetobacter baumannii GC1 and GC2 clones. mSphere, 2016, 1(3):e00117-16.

[6] Siguier P, Gourbeyre E, Chandler M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiol Rev, 2014, 38(5): 865-891.

[7]Harmer CJ, Moran RA, Hall RM. Movement of IS26-associated antibiotic resistance genes occurs via a translocatable unit that includes a single IS26 and preferentially inserts adjacent to another IS26. MBio, 2014, 5(5):e01801-14.

[8] He S, Hickman AB, Varani AM, et al. Insertion sequence IS26 reorganizes plasmids in clinically isolated multidrug-resistant bacteria by replicative transposition. MBio, 2015, 6(3):e00762.

[9] Harmer CJ, Hall RM. IS26-Mediated precise excision of the IS26-aphA1a translocatable unit. MBio, 2015, 6(6):e01866-15.

[10] Harmer CJ, Hall RM. IS26-Mediated formation of transposons carrying antibiotic resistance genes. mSphere, 2016, 1(2):e00038-16.

[11] Gillings MR. Integrons: past, present, and future. Microbiol Mol Biol Rev, 2014, 78(2):257-277.

The mechanism of insertion sequence IS6100 mediated transfer of DNA sequences

NIE Lu, WU Kui-hai, CHEN Wen-jing, LI Wei-xuan

Medical Laboratory, The First People’s Hospital of Foshan, Guangdong 528000, China

The insertion element IS6100 is closely related to antibiotic resistance transfer in bacteria. Here we aim to explore the possible origin of IS6100 and its mechanism of horizontal transfer of DNA fragments.

Taking the plasmid or chromosome DNA containing two or more copies of the IS6100 element in the GenBank library as the research object, the target site duplication (TSD) flanking each IS6100 was analyzed by bioinformatics tools, and the potential mechanism of the transposase encoded by IS6100 is speculated.

A total of 22 DNA sequences including 5 chromosome, 16 plasmid sequences, and a transposon sequence of unknown location were founded. Among them, 13 sequences (59%) were from DNA ofand the rest were from chromosomes or plasmids of conditional pathogens. Instrain TKS, the copy number of IS6100 was as many as 29, and the GC% content of the IS6100 or genome was close to 60%. Thirty-five different 8 bp TSDs were present in these strains with a frequency of 2-8. The GC% content of TSD was between 13% and 100%, and the GC% content in 87% (30/35) TSD sequences was ≥ 50%. These TSDs occurred simultaneously in the chromosome and/or plasmid of the same strain or different strains.

IS6100 may originated from strains of. IS6100 has no high selectivity for its target site, but still tends to act on high GC% sites. Two IS6100s can form a composite transposon and transfer a DNA sequence between them, and these transposition events can occur intermolecularly and intramolecularly.

DNA transposable elements; Gene transfer, horizental; IS6100; Resistance mechanism

LI Wei-xuan, Email:lwx21cn@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.009

李煒煊，Email：lwx21cn@163.com

2019-05-02