李聰，王燕，趙曉麗，王真，蔣建東

鴉膽子素A誘導非小細胞肺癌細胞株H460凋亡及機制的初步研究

李聰，王燕，趙曉麗，王真，蔣建東

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所（李聰、王燕、蔣建東），醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（趙曉麗、王真）

考察鴉膽子素A（BA）對人非小細胞肺癌細胞系 H460 細胞凋亡的影響和作用機制。

用 BA 對 H460 細胞進行處理，采用 MTT 法檢測細胞增殖情況，并利用 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測 BA 對 H460 細胞凋亡的影響。Hoechst 33342 染色和免疫熒光染色觀察細胞凋亡時染色質(zhì)的凝集以及 DNA 損傷標志蛋白 γ-H2AX 表達情況。Western blot 和RT-PCR 檢測 H460 細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達水平。

MTT 結(jié)果表明，與對照組相比，BA 能顯著抑制 H460 細胞增殖。對 A549、H1299、H1355 三株非小細胞肺癌細胞系進行抑制增殖作用檢測，結(jié)果顯示 BA 對三株細胞系均有不同程度抑制作用。BA 作用 48 h 后，各濃度 BA 處理 H460 細胞凋亡率均高于對照組，具有時間依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義。BA 處理組可見明顯的染色質(zhì)凝集，細胞核碎片化，DNA 損傷標志蛋白 γ-H2AX 表達明顯增加。Western blot 結(jié)果顯示，BA 作用 48 h 后，促凋亡蛋白 Bax 表達升高，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達降低，與對照組相比，Bax/Bcl-2 比值顯著升高。同時與對照組相比，凋亡通路中的 cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 表達明顯增加，并引起凋亡標志蛋白 PARP 切割。RT-PCR 結(jié)果顯示，BA 處理 H460 細胞后，與對照組相比，Bcl-2 基因表達顯著降低。

BA 能抑制人非小細胞肺癌細胞株 H460 細胞增殖，顯著誘導其凋亡，該作用與 BA 引起 DNA 損傷并激活線粒體凋亡通路有關(guān)。

鴉膽子素； 細胞凋亡； 癌，非小細胞肺； H460 細胞

肺癌是世界上發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）占到 85%。統(tǒng)計顯示，NSCLC 患者 5 年生存率極低（約 15%），原因是患者早期癥狀不明顯，約有 75% 的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期[1]，平均生存期僅為 4 個月[2]。目前的治療方法主要是手術(shù)治療、放化療、免疫治療、分子靶向治療以及藥物輔助治療等[3-4]。手術(shù)方法和放化療是臨床常用治療手段，但具有一定局限性；免疫治療和分子靶向治療，應用時間尚短，其安全性和有效性仍需進一步認證[5-6]。目前，從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性化合物是新藥發(fā)現(xiàn)的主要途徑，植物來源的紫杉醇、長春新堿等已廣泛應用于臨床治療，因此尋找新的活性高、毒副作用小的藥物迫在眉睫。近年來，研究人員嘗試從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)能有效抑制惡性腫瘤的活性成分用于非小細胞肺癌的治療。

鴉膽子素 A（bruceine A，BA）又稱鴉膽子苦素 A，是從植物鴉膽子[(Linnaeus) Merrill]果實中提取分離的苦木內(nèi)酯類化合物。中醫(yī)認為，鴉膽子味苦、性寒，有小毒，歸大腸、肝經(jīng)，有清熱、解毒、截瘧、止痢和腐蝕贅疵之功效[7]。在我國南部地區(qū)，鴉膽子多用作抗瘧藥，臨床常將鴉膽子油乳劑用于肺癌及肺癌腦轉(zhuǎn)移、肝癌和消化道腫瘤的輔助治療。有研究表明鴉膽子油乳劑具有誘導細胞凋亡達到人急性髓性白血病的潛力[8]，但關(guān)于鴉膽子中的單體成分 BA 是否具有抗腫瘤作用，目前尚無實驗數(shù)據(jù)。本實驗擬利用 H460 細胞這一 NSCLS 細胞株，針對 BA 進行體外抗腫瘤作用研究，主要觀察其抑制H460 細胞增殖及誘導凋亡作用，同時探討 BA 作用下 H460 細胞發(fā)生凋亡的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 鴉膽子素 A（CAS 25514-31-2，HPLC ≥ 98%）購自南京春秋生物工程有限公司；人非小細胞肺癌細胞株 H460 購自美國 ATCC；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國 Gibco 公司；RPMI1640 細胞培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)用磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.25% 胰蛋白酶、10000 U/ml 青霉素 G-鏈霉素均購自美國 Hyclone 公司；RNase A、四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國 Amresco 公司；PVDF 膜、ECL 化學發(fā)光顯色液購自美國 Millipore 公司；Bradford 蛋白定量試劑、5 ×上樣緩沖液由普利萊基因技術(shù)有限公司提供；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；Hoechst 33342 和 β-actin（A1978）抗體購自美國 Sigma 公司；細胞裂解液、Western blot 所用一抗購自美國 Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他無機試劑均由北京化工廠提供。

1.1.2 儀器 CKX41 倒置顯微鏡購自日本 Olympus 公司；37081 熒光顯微鏡購自德國 Carl Zeiss 公司；Mikro 200R 低溫離心機購自德國Hettich Zentrifugen公司；Centrifuge 5424 高速離心機購自德國Eppendorf 公司；165-8001 蛋白垂直電泳儀、170-3940 蛋白半干轉(zhuǎn)膜儀、Model 680 酶標儀均購自美國 Bio-Rad 公司；Amersham Imager 600 凝膠成像儀購自美國 GE 公司；FACS Calibur 流式細胞儀購自美國 BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將非小細胞肺癌細胞株 H460 細胞常規(guī)復蘇后用RPMI1640 細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，在使用前加入 10%（v/v）FBS、100 U/ml 青霉素 G和 100 μg/ml 鏈霉素，細胞置于 37 ℃和 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 實驗 取對數(shù)生長期的細胞，消化計數(shù)，以 5 × 103/孔（100 μl）接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 h 后，加入用培養(yǎng)基配置的不同濃度藥物 100 μl，每個濃度設置 3 個平行孔，并設不加藥物的溶劑對照組和無細胞的空白對照組。加藥作用 48 h 后，每孔避光加入 20 μl MTT（5 mg/ml），37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸凈孔內(nèi)液體，每孔加 150 μl DMSO，在微量振蕩器上輕輕振搖 7 min，用酶標儀于 570 nm 波長處測定吸光度值。以不加藥物的溶劑對照組細胞活力作為 100%，計算細胞增殖率。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞以 3 × 105/孔接種于六孔板中，待細胞貼壁后用藥物處理細胞 48 h，同時設置空白對照組。消化收集細胞（包括懸浮細胞和貼壁細胞），用預冷的 PBS 洗滌兩次，根據(jù) Annexin V-FITC/PI 染色試劑盒說明書操作染色后，上流式細胞儀檢測。實驗重復 3 次。

1.2.4 Hoechst 33342 染色 取對數(shù)生長期細胞消化計數(shù)，以 1 × 105/孔接種于六孔板，待細胞貼壁后分別用 0.5、5、20 μmol/L 濃度的 BA 處理細胞 48 h后，棄去培養(yǎng)基，加入用新鮮培養(yǎng)基配制的2 μg/ml Hoechst 33342 染色液，1 ml/孔。避光染色 15 min，PBS 清洗兩次后，加入新鮮培養(yǎng)液，于熒光顯微鏡觀察細胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集現(xiàn)象并拍攝圖片。

1.2.5 免疫熒光染色 六孔板中加入無菌蓋玻片，取對數(shù)生長期的細胞接種于六孔板中，待細胞貼壁后用 0.5、5、20 μmol/L BA 處理細胞 48 h，制作細胞爬片。將爬好細胞的玻片用 PBS 洗3 次，4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 洗 3 次，0.5% Triton X-100 通透 20 min，吸干表面 PBS，滴加山羊血清室溫封閉 1 h，吸掉封閉液直接滴加稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜。次日，PBST 浸洗 3 次，吸干多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗（FITC），避光孵育 1 h，隨后 PBST 洗 3 次，吸干殘余液體染核，封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.6 Western blot 檢測蛋白水平變化 取 H460 細胞以 3 × 105/孔的密度接種于六孔板中，待細胞貼壁后加藥物處理細胞 48 h，收集細胞（冰上操作），PBS 清洗，收集細胞沉淀。根據(jù)細胞沉淀的體積，加入細胞裂解液。冰上裂解 30 min，12 000 r/min、4 ℃離心 15 min，收集上清即為蛋白提取液，根據(jù) Bradford 法測得的蛋白濃度，按照 20 μg/管分裝后上樣，根據(jù)蛋白分子量大小用 10% 和 15% SDS-PAGE 進行電泳，采用半干轉(zhuǎn)膜法將目的蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉封閉 1 h，漂洗，加一抗 4 ℃孵育過夜，次日取出 PVDF 膜，洗去未結(jié)合的抗體，加入二抗溶液，室溫下反應 1 h，洗膜，用 ECL 免疫印跡試劑盒進行顯色，通過 Amersham Imager 600 凝膠成像系統(tǒng)捕獲圖像。

1.2.7 RT-PCR 檢測基因表達 H460 細胞消化計數(shù)后接種于六孔板，待細胞貼壁用 BA 處理，48 h 后，Trizol 裂解提取 RNA，測定濃度后，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，隨后進行 RT-PCR，體系為 20 μl。結(jié)果以 GAPDH 為內(nèi)參進行分析。引物序列如下：Bcl2：forward 5' ACGACTTCTCCCGCCGCTACC 3'；reverse 5' ACAATCCTCCCCCAGTTCACCC 3'；GAPDH：forward 5' GGATGATGTTCTGGAAGAGC C 3'；reverse 5' AACAGCCTCAAGA TCATCAGC 3'。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 BA 化學結(jié)構(gòu)及其對 H460 細胞增殖的影響

圖 1A 為 BA 的化學結(jié)構(gòu)。不同濃度 BA 處理細胞 48 h 后，與對照組相比，細胞活力明顯下降，低濃度即可顯著抑制細胞增殖（圖 1B）。給予 0.5 μmol/L BA 分別作用 12、24、48、72 h 后，結(jié)果顯示，隨時間增加 BA 顯著抑制 H460 細胞增殖，該效應具有時間依賴性（圖 1C）。增加 H1299、H1355、A549 三株非小細胞肺癌細胞系，檢測 BA 對其增殖影響，結(jié)果可見，BA 能不同程度抑制這 4 種細胞增殖，與對照組相比具有顯著差異（圖 1D）。

圖 1 BA 化學結(jié)構(gòu)及其對細胞增殖的影響（A：BA 化學結(jié)構(gòu)；B：不同濃度BA 對H460 細胞增殖影響；C：不同作用時間對H460 細胞增殖影響；D：BA 對不同細胞系增殖影響；與對照組相比，*P < 0.001）

Figure 1 Chemical structure of BA and the proliferation inhibition of cells induced by BA (A: Chemical structure of BA; B: Effects of different concentration of BA for 48 h on proliferation of H460 cells; C: A time-dependent manner with 0.5 μmol/L BA; D: Effect of BA on proliferation of different cell lines, cells were treated with BA for 48 h;*< 0.001 vs. control)

2.2 BA 對細胞凋亡的影響

利用流式細胞術(shù)檢測 BA 對 H460 細胞凋亡的影響。不同濃度 BA（0.5、5、20 μmol/L）處理 H460 細胞，其凋亡率分別為（31.77 ± 1.81）%、（34.31 ± 1.53）%、（47.45 ± 6.18）%，明顯高于對照組（3.16 ± 0.85）%（圖 2A）。5 μmol/L BA 作用 H460 細胞 24、48、72 h 后，H460 細胞凋亡率分別為（20.44 ± 3.71）%、（30.29 ± 1.79）%、（47.56 ± 1.31）%，與對照組相比具有顯著性差異（圖 2B）。提示 BA 可顯著誘導 H460 細胞凋亡。

2.3 BA 引起細胞核染色質(zhì)凝集

Hoechst 33342 進行細胞核染色，經(jīng)熒光顯微鏡觀察可見，對照組細胞核完整，呈卵圓形，未見凋亡細胞（圖 3A）。BA 處理 48 h 后，隨藥物濃度增加，細胞核出現(xiàn)固縮、碎片化等典型的細胞凋亡形態(tài)學改變（如圖中箭頭處所示），隨 BA 濃度升高，凋亡細胞數(shù)目增多（圖 3B ~ D）。

2.4 BA 對 γ-H2AX 表達的影響

采用免疫熒光檢測細胞內(nèi) γ-H2AX 表達情況，結(jié)果如圖 4 所示，不同濃度BA 處理 H460 細胞 48 h 后，細胞內(nèi) γ-H2AX 蛋白（圖中為綠色熒光）表達增加，且具有劑量依賴性。

2.5 BA 對細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot 結(jié)果（圖 5A）顯示，BA 處理H460 細胞 48 h 后，cleaved caspase-9 和 cleaved caspase-3 表達增加，以及 PARP 蛋白切割，提示 BA 誘導 H460 凋亡可能是經(jīng)由線粒體通路，通過激活 caspase-9 誘導細胞凋亡。隨后，針對凋亡發(fā)生機制展開進一步研究發(fā)現(xiàn)，促凋亡蛋白 Bax 隨 BA 濃度的升高表達量增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達減少，與對照組相比，Bax/Bcl-2 比值明顯升高（圖 5B），此外，圖 5C 中 Bcl-2 mRNA 表達顯著降低（< 0.01），揭示 BA 通過調(diào)節(jié) Bax 和 Bcl-2 表達誘導細胞凋亡。

圖 2 BA 對 H460 細胞凋亡的影響（A：濃度依賴性；B：時間依賴性；C：凋亡率直方圖；與對照組相比，*P < 0.001）

Figure 2 Apoptotic cell death of the H460 cells was induced by BA (A: A dose-dependent manner; B: A time-dependent manner; C: The corresponding histograms of A and B;*< 0.001 vs. control)

圖 3 Hoechst 33342 染色觀察BA作用H460 細胞48 h 后細胞核的變化（× 100）（A：空白對照組；B：0.5 μmol/L；C：5 μmol/L；D：20 μmol/L；標尺= 100 μm）

Figure 3 The effect of BA on the H460 cells at 48 h was viewed using Hoechst 33342 staining (× 100) (A: Control; B: 0.5 μmol/L; C: 5 μmol/L; D: 20 μmol/L; Bar = 100 μm)

圖 4 免疫熒光檢測BA 對細胞內(nèi)γ-H2AX 蛋白含量的影響

Figure 4 The effect of BA on the expression of γ-H2AX in the H460 cells

3 討論

臨床上，鴉膽子油乳劑常用于肺癌、肝癌、消化道癌癥的輔助治療。BA 是鴉膽子果實中提取的單一化合物，目前關(guān)于 BA 的研究較少，多局限于提取分離以及治療犬類疾病[9-10]，對于其藥理作用尤其是抗癌作用及機制研究方面尚無報道[11-13]。針對單體化合物 BA 誘導 H460 細胞凋亡作用及機制的研究將為非小細胞肺癌的臨床治療提供研究基礎。

本實驗中，采用不同濃度 BA 處理 H460 細胞 48 h，MTT 結(jié)果顯示 BA 能顯著抑制 H460 細胞增殖（< 0.001）。另選擇三株非小細胞肺癌細胞系 H549、H1299、H1355，檢測 BA 抑制其增殖情況，結(jié)果顯示 BA 對不同細胞系均有顯著抑制作用，其中對 A549 和 H1355 細胞抑制作用更強。利用 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測 H460 細胞凋亡率，結(jié)果顯示隨藥物濃度增加，細胞凋亡率明顯升高。Hoechst 33342 染色發(fā)現(xiàn)，BA 能引起 H460 細胞染色質(zhì)凝集，細胞核碎片化。免疫熒光結(jié)果同樣印證，BA 能誘導 H460 細胞凋亡，表現(xiàn)為 DNA 雙鏈斷裂標志蛋白γ-H2AX含量增加。γ-H2AX 屬于組蛋白家族成員之一，為磷酸化激活狀態(tài)，是檢測 DNA 損傷的標志蛋白[14]，其表達量增加，說明 BA 處理 H460 細胞可能引起細胞 DNA 損傷，但是目前尚不清楚 DNA 損傷是否是 BA 誘導 H460細胞凋亡的機制，有待進一步實驗驗證。

圖 5 BA對H460 細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響（A：BA 對凋亡相關(guān)蛋白表達影響；B：Bax/Bcl-2 比值；C：BA 對Bcl-2 mRNA 表達的影響；與對照組相比，**P < 0.01，*P < 0.001）

Figure 5 The effects of BA on apoptosis-related protein expression in H460 cells (A: Expression of apoptosis-related proteins; B: Ratio of Bax/Bcl-2 expression; C: Bcl-2 mRNA expression in the H460 cells;**< 0.01 and*< 0.001 vs. control)

細胞凋亡即細胞的程序性死亡，主要有兩條途徑調(diào)節(jié)：第一種是外源性或細胞質(zhì)途徑，由 FAS 死亡受體激活；第二種是內(nèi)源性或線粒體途徑，線粒體內(nèi)的細胞色素 C 釋放，激活 caspase-9 引起級聯(lián)反應[15]。兩種途徑最終都匯合到共同的半胱天冬氨酸蛋白酶途徑，活化 caspase-3 級聯(lián)反應，降解細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能蛋白，引起細胞死亡[16]。實驗證明 BA 能誘導 H460 細胞凋亡，為檢測其作用機制，對凋亡通路蛋白（caspase-9、caspase-3）及其作用底物 PARP 表達量進行 Western blot 檢測，結(jié)果顯示 cleaved caspase-9 和 cleaved caspase-3 表達水平隨 BA 濃度增加而升高，提示 BA 誘導 H460 細胞凋亡可能與激活線粒體途徑相關(guān)。Bcl-2 家族蛋白是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要分為兩類，促凋亡蛋白：Bax、Bak、Bad、Bcl-Xs等和抑制凋亡蛋白：Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W 等[17]。兩者通過促進或抑制細胞色素 C 的釋放發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[18]。Western blot 檢測 Bax 和 Bcl-2 表達水平發(fā)現(xiàn)，隨給藥濃度增加，Bax 表達升高，Bcl-2 表達降低，提示 BA 通過調(diào)節(jié) Bax/Bcl-2 比值誘導H460 凋亡。此外，RT-PCR 結(jié)果提示，BA 能抑制 Bcl-2 mRNA 表達，其結(jié)果與 Western blot 結(jié)果一致。

綜上所述，BA 能在體外誘導 H460 細胞凋亡，抑制其增殖，其作用機制主要是通過升高Bax/Bcl-2 比值，激活線粒體通路中的 caspase-9，活化下游caspase-3，最終引起細胞凋亡。此外 BA 誘導 H460 細胞發(fā)生 DNA 損傷也可能為其潛在的抗腫瘤機制之一。BA 作為一種天然的單體化合物，其對 H460 細胞的作用及作用機制仍需深入研究。本實驗只是驗證了其對 H460 細胞體外作用情況，后續(xù)實驗會進一步擴大 BA 抑瘤譜，針對 EGFR 突變細胞系和對 EGFR 具有抗藥性細胞系進行進一步研究，并針對 Bcl-2 家族調(diào)節(jié)蛋白上游通路進行檢測，同時開展體內(nèi)動物實驗，為 BA 應用于非小細胞肺癌的臨床治療提供參考依據(jù)。

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Bruceine A induces apoptosis in non-small-cell lung cancer cell line H460 by regulating mitochondria-related apoptosis signaling

LI Cong, WANG Yan, ZHAO Xiao-li, WANG Zhen, JIANG Jian-dong

Institute of Materia Medica (LI Cong, WANG Yan, JIANG Jian-dong), Institute of Medicinal Biotechnology (ZHAO Xiao-li, WANG Zhen), Chinese Academy of Medical Sciences & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

We aim to investigate whether bruceine A (BA) induces apoptosis in human non-small-cell lung cancer cell (NSCLC) H460 cells and to learn the mechanism.

The proliferation of NSCLC cell lines, including H460, A549, H1299 and H1355, was detected by the MTT assay after treatment with BA. Effect of BA on apoptosis in the H460 cells was measured by FACS analysis with Annexin V-FITC/PI staining. Hoechst 33342 and immunofluorescence (IF) staining were used to observe the chromatin condensation and the expression of the DNA damage marker protein γ-H2AX, respectively. Western blot and real-time PCR were used to detect the expression of apoptosis-related protein and mRNA in the H460 cells, respectively.

Based on MTT result, the proliferation was significantly inhibited in H460 cells after treatment with BA for 48 h. The proliferation inhibition of other NSCLC cell lines A549, H1299 and H1355 upon BA treatment was detected, and BA inhibited the proliferation of the three cell lines in a dose-dependent manner. Significant induction of apoptosis was observed in a time-dependent fashion upon BA treatment in the H460 cells. Also, remarkable nuclear condensation was observed following BA treatment in H460 cells using Hoechst 33342 staining. DNA damage marker γ-H2AX was increased by BA as evidenced by IF staining. Furthermore, BA increased and decreased the expression of Bax and Bcl-2, respectively, and cleaved caspase-9, caspase-3 and PARP protein, as demonstrated by Western blot. Also, Bcl-2 gene expression in the H460 cells was significantly decreased after BA treatment.

BA inhibits the H460 cells proliferation by inducing apoptosis, which may be mediated through the mitochondria-dependent apoptotic signaling pathways.

BRUCEINE; Apoptosis; Carcinoma, non-small-cell lung; H460 cell

JIANG Jian-dong, Email: jiang.jdong@163.com; WANG Zhen, Email: wangzhen@imb.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.002

國家自然科學基金（500101206）

蔣建東，Email：jiang.jdong@163.com；王真，Email：wangzhen @imb.pumc.edu.cn

2019-03-06