孫彬裕，曲守方，于婷，孫楠，孫晶，胡澤斌，黃杰

抗A抗B血型定型試劑（單克隆抗體）國家參考品的建立

孫彬裕*，曲守方*，于婷，孫楠，孫晶，胡澤斌，黃杰

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所

ABO 血型系統(tǒng)是人類第一個血型系統(tǒng)，也是人類血型系統(tǒng)中抗原免疫性最強(qiáng)的[1]。至今人們已發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞上有 36 個血型系統(tǒng)，300 多種血型抗原。ABO 血型系統(tǒng)是臨床輸血和器官移植中最重要的血型系統(tǒng)，對獻(xiàn)血者和受血者 ABO 血型的預(yù)先確認(rèn)是輸血工作中最為重要的實驗，錯誤的 ABO 血型定型將導(dǎo)致嚴(yán)重的輸血反應(yīng)[2-3]?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程》（2015 版）對血型檢測項目規(guī)定的強(qiáng)制檢測項目就是ABO 正確定型[4]。ABO 血型鑒定必須同時進(jìn)行正反定型試驗，使兩者的檢測結(jié)果相互驗證，才算定型正確。正定型是用已知的抗 A 和抗 B 血型定型試劑測定紅細(xì)胞上有無相應(yīng)的 A 抗原或（和）B 抗原；反定型是用已知 ABO 血型的紅細(xì)胞測定血清中有無相應(yīng)的抗 A 抗體或（和）抗 B 抗體[5]?？?A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）是按照生物制品管理的用于血液篩查的體外診斷試劑產(chǎn)品，目前需要批簽發(fā)。國家藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了 8 個國內(nèi)外不同公司的抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體），應(yīng)用于正定型鑒定 ABO 血型。

抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）進(jìn)行效價測定時，可能會因為不同實驗者試驗方法和主觀判斷等因素，影響實驗結(jié)果。目前國際通用的方法是制備統(tǒng)一的參考品用來限定血型定型試劑產(chǎn)品的最低效價，要求試劑的效價應(yīng)不低于參考品的效價[6]。《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部明確規(guī)定了正定型類抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）的通則，并要求其對紅細(xì)胞的凝集效價應(yīng)不低于國家參考品的同步測定結(jié)果[7]。因此本實驗室開展了抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品的研制工作，該參考品可以規(guī)范抗 A 抗 B 血型定型試劑效價的檢測，促進(jìn)測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 抗 A 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液（細(xì)胞株為 SRBC-B3 和 9113D10）和抗 B 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液（細(xì)胞株為 SRBC-C 和 9621A8），效價為 1:2048，由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 儀器 90-1 型恒溫磁力攪拌器購自上海精科實業(yè)有限公司；QL-901 型漩渦混合器購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Microlab?540B 配液儀購自瑞士 Hamilton 公司；DT5-3 血型離心機(jī)購自北京時代北利離心機(jī)有限公司；YB-IIA 型澄明度檢測儀購自天津市精拓儀器科技有限公司。

1.1.3 試劑 紅細(xì)胞為 3 d 內(nèi)新鮮采集的紅細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 制備及檢測

1.2.1.1 制備 將原料抗 A 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和抗 B 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入等體積的賦形劑（蔗糖溶液），充分混勻后，配制成參考品候選品溶液，置于 2 ~ 8 ℃過夜。次日經(jīng) 0.22 μm 濾膜無菌過濾，按每支安瓿 1.0 ml 進(jìn)行分裝。凍干制備成抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品。

1.2.1.2 檢測 實驗室按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部要求，對抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品進(jìn)行外觀、特異性、親和力、效價、冷凝集素和不規(guī)則抗體等項目的檢測。

外觀：參考品使用時應(yīng)先用 1.0 ml 去離子水將內(nèi)容物完全復(fù)溶，再加入 5.0 ml 2% 牛血清白蛋白生理鹽水配制成標(biāo)準(zhǔn)液備用。選擇 2200 光照度（lx），手持瓶頸部于遮光板邊緣處，輕輕旋轉(zhuǎn)和翻轉(zhuǎn)容器使藥液中可能存在的可見異物懸?。ㄗ⒁獠皇顾幰寒a(chǎn)生氣泡），在明視距離（供試品至人眼的清晰觀察距離，通常為 25 cm）分別在黑色和白色背景下目測 20 s，肉眼觀察液體情況。

特異性：取試管排 2 行，每行4 支試管，每行分別加入抗 A 血型試劑國家參考品和生理氯化鈉 0.1 ml，每列分別加入2% A1、A2B、B、O 型紅細(xì)胞懸液 0.1 ml；取試管排 2 行，每行3 支試管，每行分別加入待檢抗 B 血型試劑國家參考品和生理鹽水 0.1 ml，每列分別加入2%A1、B、O 型紅細(xì)胞懸液 0.1 ml。置 18 ~ 25 ℃ 15 min，經(jīng)1000 r/min 離心 1 min，肉眼觀察凝集結(jié)果。

親和力：將待檢抗 A 血型試劑國家參考品 0.05 ml 置潔凈玻片上，加入等體積10% A1、A2、A2B 型紅細(xì)胞懸液；將待檢抗 B 血型試劑國家參考品 0.05 ml 置潔凈玻片上，加入等體積10% B 型紅細(xì)胞懸液。立即混勻，滴入紅細(xì)胞懸液同時記錄肉眼可見凝集出現(xiàn)時間以及凝塊大小。

效價：取試管排成2 排，每排10 支，自第一管起每支各加生理氯化鈉溶液0.1 ml，加待檢試劑0.1 ml，2 倍系列稀釋，然后加2% 相應(yīng)紅細(xì)胞懸液0.1 ml，搖勻，于18 ~ 25 ℃放置 15 min，經(jīng) 1000 r/min 離心 1 min，同時用生理氯化鈉溶液做紅細(xì)胞懸液對照。效價以產(chǎn)生“+”凝集的待檢試劑最高稀釋度計算，不計紅細(xì)胞懸液體積，2 排試管終點相同作為待檢試劑凝集效價，如果 2 排試管終點相差 1 管，則以凝集效價低的判為終點，如 2 排試管終點相差 2 管或以上，需重新進(jìn)行標(biāo)定實驗。

冷凝集素和不規(guī)則抗體測定：隨機(jī)取 10 例非血緣性 O 型紅細(xì)胞、3 例A 型紅細(xì)胞和 3 例 B 型紅細(xì)胞，分別用生理氯化鈉溶液配成 2% 紅細(xì)胞懸液，用 20% 牛白蛋白生理氯化鈉溶液配成 5% 紅細(xì)胞懸液。每一待檢試劑排3 排試管，每排 13 支，各加待檢試劑 0.1 ml，前 10 管分別加入 O 型 2% 紅細(xì)胞懸液 0.1 ml，后 3 管分別加入B 型 2% 紅細(xì)胞懸液 0.1 ml（測待檢抗 A 試劑）或者加入A 型2% 紅細(xì)胞懸液 0.1 ml（測待檢抗 B 試劑），第一排置 4 ℃，第二排置 18 ~ 25 ℃，第三排置 37 ℃，靜置 2 h。牛白蛋白介質(zhì)按上法進(jìn)行，排成兩排，分別置 18 ~25 ℃及 37 ℃，靜置 2 h，觀察凝集結(jié)果。

1.2.2 瓶間精密度實驗 隨機(jī)抽取 2 支抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品，各協(xié)作標(biāo)定實驗室按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部要求檢測試劑效價和親和力，平行進(jìn)行分析測定，并統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.3 熱穩(wěn)定性實驗 隨機(jī)抽取抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品進(jìn)行穩(wěn)定性試驗。將國家參考品置 37 ℃放置 3、7、14 d 后，各協(xié)作標(biāo)定實驗室檢測效價和親和力。以–20 ℃保存的國家參考品（記為 0 周）為對照，對熱穩(wěn)定性的國家參考品平行進(jìn)行分析測定。

1.2.4 效價協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 四家協(xié)作標(biāo)定實驗室按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部要求檢測試劑效價，平行進(jìn)行分析測定，并統(tǒng)計效價結(jié)果，確定抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品的效價。

2 結(jié)果

2.1 國家參考品檢測結(jié)果

外觀檢測：抗 A 血型定型試劑國家參考品為藍(lán)色凍干粉末，抗 B 血型定型試劑國家參考品為黃色凍干粉末。復(fù)溶后外觀抗 A 血型定型試劑國家參考品為藍(lán)色透明液體、抗 B 血型定型試劑國家參考品為黃色透明液體，均無搖不散的沉淀和異物。特異性檢測：抗 A 血型試劑國家參考品與 A1、A2B 型紅細(xì)胞凝集，與 B、O 型紅細(xì)胞不凝集，沒有溶血等不易分辨的現(xiàn)象；抗 B 血型試劑國家參考品與 B 紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集，與 A1、O 型紅細(xì)胞不產(chǎn)生凝集，沒有溶血等不易分辨的現(xiàn)象。親和力檢測：與相應(yīng)的紅細(xì)胞的凝集時間均在 15 s 以內(nèi)，3 min 凝集塊 > 1 mm2。效價檢測：抗 A 血型定型試劑國家參考品結(jié)果為對 A1 細(xì)胞 1:256，對 A2 細(xì)胞 1:128，對 A2B 細(xì)胞 1:128，抗 B 血型定型試劑國家參考品結(jié)果為對 B 細(xì)胞 1:256，見表 1。冷凝集素和不規(guī)則抗體檢測的結(jié)果均為無凝集反應(yīng)或溶血現(xiàn)象。各項結(jié)果均符合《中華人民共和國藥典》（2015 年版）中的規(guī)定。

2.2 瓶間精密度實驗結(jié)果

按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部要求，對抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品的效價和親和力進(jìn)行檢測，結(jié)果均為對 A1細(xì)胞的效價 1:256，對 A2細(xì)胞的效價為 1:128，對 A2B 細(xì)胞的效價為 1:128，對 B 細(xì)胞的效價為 1:256，結(jié)果表明瓶間效價無顯著差異。

表 1 熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果

續(xù)表 1

2.3 熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果

將國家參考品在 37 ℃放置 3、7、14 d 后，進(jìn)行效價和親和力檢測，并與–20 ℃保存的國家參考品（作為0 周）效價比較，效價一致且均未下降，親和力的結(jié)果也符合藥典的要求，即相應(yīng)的紅細(xì)胞的凝集時間均在 15 s 以內(nèi)（表 1），3 min 凝集塊> 1 mm2。實驗結(jié)果表明國家參考品非常穩(wěn)定。

對各協(xié)作標(biāo)定實驗室的標(biāo)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析和匯總，見表 2。效價為抗 A 血型定型試劑國家參考品對 A1細(xì)胞 1:256，對 A2細(xì)胞 1:128，對 A2B 細(xì)胞 1:128，抗 B 血型定型試劑國家參考品對 B 細(xì)胞 1:256。

表 2 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

3 討論

ABO 血型是人類穩(wěn)定的遺傳標(biāo)志物，ABO 抗原不僅存在于紅細(xì)胞膜上，也廣泛存在于人體的體液和分泌液中。傳統(tǒng)的 ABO 分型是采用血清學(xué)方法。ABO 血型鑒定的原理基于抗原和抗體反應(yīng)所產(chǎn)生的細(xì)胞凝集，通過正定型（細(xì)胞定型試驗）和反定型（血清定型試驗），判定 ABO 血型。而正定型的抗 A 抗 B 血型定型試劑的效價是該產(chǎn)品一項重要的技術(shù)指標(biāo)。但是各家產(chǎn)品測定結(jié)果有明顯的差異性，所以研制抗 A 抗 B 血型定型試劑國家參考品能規(guī)范抗 A 抗 B 血型定型試劑效價的檢測。

體外診斷試劑質(zhì)量的提高有賴于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水平的提高和完善。產(chǎn)品注冊檢測工作中如果缺乏統(tǒng)一的國家參考品，檢測時只能由企業(yè)提供自己的參考品。如果缺乏統(tǒng)一的尺度，勢必給試劑盒的注冊和上市后的監(jiān)管工作帶來很大的影響。為了加強(qiáng)抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）質(zhì)量的控制，迫切需要建立用于效價評價用的國家參考品，以便對市場上的抗 A 抗 B 血型定型試劑進(jìn)行科學(xué)合理的監(jiān)管。建立的抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）國家參考品，可以用于評價試劑盒的效價評價，對于提高產(chǎn)品的質(zhì)量具有十分重要的意義。

抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）是按照生物制品管理的體外診斷試劑產(chǎn)品，在《中華人民共和國藥典》（2015 年版）三部里面對該產(chǎn)品的外觀、特異性、親和力、效價、冷凝集素和不規(guī)則抗體檢測進(jìn)行了詳細(xì)的規(guī)定，并要求其對紅細(xì)胞的凝集效價應(yīng)不低于國家參考品的同步測定結(jié)果。因此對該產(chǎn)品進(jìn)行效價檢測時，必須同步使用國家參考品進(jìn)行檢測。而國家參考品效價的準(zhǔn)確標(biāo)定，影響著該類產(chǎn)品的質(zhì)量評價。研究報道，不同實驗室雖然使用相同的實驗方法，但是由于不同實驗人員的操作方式以及對凝集結(jié)果的主觀判斷、不同批次的紅細(xì)胞表面抗原的差異等因素，可能會影響效價的結(jié)果[8]。為了避免紅細(xì)胞的影響因素，我們建議各個協(xié)作標(biāo)定單位使用 3 d 內(nèi)新鮮采集的紅細(xì)胞進(jìn)行檢測。抗 A 抗 B 血型定型試劑（單克隆抗體）國家參考品經(jīng)中國食品藥品檢定研究院、上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司、長春博德生物技術(shù)有限公司和北京金豪制藥股份有限公司四家單位協(xié)作標(biāo)定，效價均為對 A1細(xì)胞的效價 1:256，對 A2細(xì)胞的效價為 1:128，對 A2B 細(xì)胞的效價為 1:128。國家參考品的瓶間精密度結(jié)果為各瓶的效價均一致，表明瓶間無顯著差異。將國家參考品在 37 ℃放置3、7、14 d 后，與–20 ℃保存的國家參考品效價比較，效價均未下降，表明國家參考品穩(wěn)定性很好。該國家參考品已經(jīng)于 2018 年開始使用，效價穩(wěn)定，能夠滿足抗 A 抗 B 血型定型試劑效價的評價要求。我們同時將對該國家參考品進(jìn)行長期穩(wěn)定性研究以及期間核查，以確保長期放置后的效價依然滿足國家參考品的要求。

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*同為第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.015

黃杰，Email：jhuang5522@126.com；胡澤斌，Email：huzbcmba@163.com

2019-02-11