繆著，盧福瓊，馬波，劉馨

人間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體研究進(jìn)展

繆著，盧福瓊，馬波，劉馨

650500，昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（繆著、盧福瓊、馬波、劉馨）；653100 玉溪，云南時(shí)光肌生物技術(shù)有限公司（馬波、劉馨）

外泌體是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑為 40 ~ 100 nm，密度為 1.13 ~1.18 g/ml。隨著以干細(xì)胞技術(shù)為核心的再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）被廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，研究表明，MSC 來源的外泌體通過核內(nèi)體途徑產(chǎn)生，能夠起到與干細(xì)胞相似的生理作用，能夠保護(hù)腎臟損傷、減少心肌缺血和再灌注損傷、保護(hù)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺損傷、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能等[1]。在早期的研究中，人們將 MSC 的治療效果歸因于局部移植和分化為各種類型細(xì)胞的能力，但隨著研究的進(jìn)一步深入，人們發(fā)現(xiàn) MSC 移植入體內(nèi)后，不能長(zhǎng)期存活，大部分細(xì)胞在血管中死亡。所以，推測(cè)產(chǎn)生的治療作用可能是依賴于旁分泌機(jī)制產(chǎn)生的大量生物活性因子。大多數(shù)健康或疾病環(huán)境的細(xì)胞能夠持續(xù)釋放細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）進(jìn)入周圍環(huán)境，其中外泌體作為細(xì)胞間進(jìn)行信息交流的重要工具有望替代干細(xì)胞移植。MSC 來源的外泌體已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，主要針對(duì)急性缺血性腦中風(fēng)、難治性黃斑孔裂、1 型糖尿病和阿爾茨海默癥。因此，對(duì)外泌體的培養(yǎng)方法和相關(guān)參數(shù)、分離方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，對(duì)其蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)行嚴(yán)格分析均是其應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)。本文對(duì)人 MSC 外泌體的產(chǎn)生機(jī)制、內(nèi)容物、獲取方法進(jìn)行了綜述。

1 MSC 外泌體的生成機(jī)制

MSC 來源的外泌體通過核內(nèi)體途徑產(chǎn)生，不同細(xì)胞來源外泌體有相似的合成路徑[2]。該過程始于細(xì)胞膜表面的內(nèi)吞作用形成的早期內(nèi)吞體，早期內(nèi)吞體再成熟為晚期內(nèi)吞體，晚期內(nèi)吞體膜通過內(nèi)向出芽作用，包裹特異分選的蛋白、核酸等物質(zhì)形成多個(gè)管腔囊泡（ILVs），這種管腔囊泡即為外泌體的前體。晚期內(nèi)吞體內(nèi)包含多個(gè) ILVs 后，即成為多泡體（MVB）。隨后，大多數(shù) MVB 與溶酶體融合，導(dǎo)致 MVB 的內(nèi)含物降解，而少數(shù) MVB 的膜表面有 CD63、溶酶體跨膜蛋白（lysosomal membrane protein，LAMP）1、LAMP2 等，可介導(dǎo)其與細(xì)胞質(zhì)膜融合，并向胞外釋放外泌體[3-4]。

1.1 依賴內(nèi)吞體分選復(fù)合物機(jī)制

ILVs 與 MVB 的生成需要內(nèi)吞體分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）的輔助。ESCRT 是一種蛋白復(fù)合物，定位于內(nèi)吞體胞質(zhì)側(cè)，其主要作用為分選特異的組分進(jìn)入ILVs，進(jìn)而構(gòu)成外泌體的前體。ESCRT 包含了四種復(fù)合體（ESCRT-0、I、II、III）及輔助蛋白（VPS4、VTA1、ALIX 等），各自發(fā)揮著不同的作用。四種復(fù)合體在生成 ILVs 和 MVB 的過程中發(fā)揮的作用各不相同，ESCRT-0 識(shí)別和分隔泛素化標(biāo)記的內(nèi)吞體膜跨膜蛋白，含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)控的酪氨酸激酶，后者可以識(shí)別泛素化的蛋白；HRS 可以募集 ESCRT-I 中的 TSG-101，而后 ESCRT-I 通過 ESCRT-II 或 ALIX 蛋白的作用募集 ESCRT-III 發(fā)揮作用，使內(nèi)吞體膜通過內(nèi)向生芽作用包裹特異的內(nèi)容物；ESCRT-III 將形成的囊泡剪開。此外，ESCRT 的解離和再循環(huán)需要 ATP 酶 VPS4 的輔助作用，ESCRT-0、ESCRT-I 和 VPS4 在外泌體的生成中具有重要作用，且不同細(xì)胞的外泌體生成存在異質(zhì)性[5-6]。

1.2 非依賴內(nèi)吞體分選復(fù)合物機(jī)制

細(xì)胞不依賴 ESCRT 也可生成 ILVs 及 MVB。通過脂質(zhì)、神經(jīng)酰胺、四跨膜蛋白家族 tetraspanins 或熱休克蛋白等的作用輔助生成 ILVs 及 MVB。Tan 等[7]利用鞘磷脂酶抑制劑處理 MSC，證明外泌體的產(chǎn)生依賴于鞘磷脂酶，這與 MVB 內(nèi)泌體出芽需要神經(jīng)酰胺的假設(shè)是一致的。中性鞘磷脂酶可以水解鞘磷脂生成神經(jīng)酰胺，而抑制該酶的作用可減少神經(jīng)酰胺的生成，進(jìn)而降低 MVB 膜的內(nèi)向生芽作用，減少外泌體的生成。磷脂酶 D2 可將卵磷脂水解生成磷脂酸，磷脂酸可以像神經(jīng)酰胺一樣促進(jìn) MVB 膜的內(nèi)向生芽作用，并包裹特異的蛋白生成 ILVs，促進(jìn)外泌體的生成[8]。上述表明，磷脂酸和神經(jīng)酰胺可以不依賴 ESCRT 的作用而生成外泌體。ADP 核糖基化因子 6 是質(zhì)膜及內(nèi)吞體膜上的一種小 G 蛋白，可激活磷脂酶 D2，使卵磷脂水解生成磷脂酸。目前，tetraspanin 蛋白超家族分選外泌體內(nèi)含物的作用也已被闡明。此外，有研究發(fā)現(xiàn) CD81 也可分選一系列配體等進(jìn)入外泌體[5]。

2 MSC 外泌體的組分及生物學(xué)功能

細(xì)胞外囊泡（EV）是細(xì)胞主動(dòng)釋放的納米級(jí)膜泡，可以根據(jù)其來源、大小與生物學(xué)特性分為三類：外泌體、微囊和凋亡小體[9]，如表 1 所示。

1983 年，Johnstone 等首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)外泌體，但一直被認(rèn)為是一種細(xì)胞廢棄物。2010 年 MSC 來源外泌體首次在心肌缺血/再灌注損傷模型中被研究。研究表明，骨髓 MSC 比成肌細(xì)胞、人急性單細(xì)胞白血病細(xì)胞系（THP-1）、人胚胎腎細(xì)胞系（HEK）等能產(chǎn)生更多的外泌體。MSC 來源的微囊對(duì)部分組織器官也有再生功能，包括腎臟、神經(jīng)組織、肝臟和肺[10]。外泌體外層結(jié)構(gòu)為磷脂雙分子層，表面攜帶有來源細(xì)胞特定的膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)，內(nèi)容物豐富，例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，通過靶細(xì)胞內(nèi)化、受體-配體相互作用或脂膜融合進(jìn)行傳遞[11-12]。根據(jù)外泌體最新數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.exocarta.org/），已確定其中存在有 9769 種蛋白質(zhì)、3408 種 mRNA 和 2838 種 miRNA。

表 1 細(xì)胞外囊泡的主要類型

2.1 蛋白質(zhì)

外泌體中的蛋白來源于母細(xì)胞、內(nèi)吞途徑和細(xì)胞質(zhì)，與細(xì)胞內(nèi)吞網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，通常不包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體或細(xì)胞核蛋白質(zhì)。MSC 外泌體除表達(dá)所有外泌體共同表達(dá)的標(biāo)志物之外，還表達(dá) MSC 細(xì)胞膜上的一些黏附分子，如 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105[13-14]。另外還存在一些其他種類的蛋白，例如：可作為標(biāo)記并用于外泌體鑒定的多泡體源蛋白（例如 Alix 和 TSG101）；與維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的細(xì)胞骨架蛋白（例如肌動(dòng)蛋白和微管蛋白）；可以調(diào)節(jié)膜骨架的動(dòng)態(tài)性以及膜融合的膜聯(lián)蛋白（I、II、V 和 VI）；與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、與細(xì)胞代謝相關(guān)的載體蛋白和一些組織相容性抗原也廣泛存在于外泌體中[15]。據(jù) ExoCarta 介紹，已經(jīng)從 MSC 來源外泌體中收集了 900 多種蛋白質(zhì)。與其他細(xì)胞來源外泌體相似，MSC 外泌體的蛋白組成可以反映宿主細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)，也可以隨應(yīng)激和微環(huán)境的變化而變化，從不同批次 MSC 條件培養(yǎng)基獲得的外泌體的蛋白成分存在差異。

2.2 脂質(zhì)

MSC 外泌體具有脂筏結(jié)構(gòu)的特征，是一個(gè)在質(zhì)膜中具有內(nèi)吞活性的微結(jié)構(gòu)域。脂筏富含膽固醇和飽和磷脂，如鞘磷脂等[7]。鞘脂神經(jīng)酰胺已被證明與外泌體產(chǎn)生有關(guān)。從 MSC 外泌體中分離得到的脂肪酸包括白三烯、花生四烯酸（AA）、磷脂酸、前列腺素溶血磷脂酰膽堿（LPC）和二十二碳六烯酸（DHA）[16]。外泌體中所含有的脂質(zhì)成分與其來源細(xì)胞的種類有很大關(guān)系，也存在一定的差異。這些脂類分子不僅參與了維持外泌體的形態(tài)，還可以作為信號(hào)分子參與許多生物學(xué)過程。如：對(duì) Notch 等腫瘤生存信號(hào)通路的抑制，引起細(xì)胞凋亡，以及對(duì)前列腺素、磷酸激酶 A2、磷酸激酶 C 和磷酸激酶 D 等中間信號(hào)分子的傳遞，參與細(xì)胞間通訊[17]。雖然脂質(zhì)在囊泡穩(wěn)定性中起著重要作用，但MSC 外泌體脂質(zhì)的生物學(xué)和藥理作用仍有待進(jìn)一步闡明[16]。

2.3 核苷酸

外泌體含有大量具有生物活性的遺傳學(xué)物質(zhì)，這是把外泌體與囊泡區(qū)分開來的最重要特征。MSC 外泌體內(nèi)的核酸主要有 miRNA 和 mRNA。許多 miRNA 已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在 MSC 來源外泌體中參與生理和病理過程，如機(jī)體發(fā)育、表觀遺傳調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生和進(jìn)展[18]。mRNA 可以參與細(xì)胞周期、血管生成及組蛋白修飾等進(jìn)程[19]。miR-16 是一種在 MSC 來源外泌體中富集的 miRNA，靶向體內(nèi)和體外腫瘤中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），下調(diào)其表達(dá)來抑制血管生成和腫瘤進(jìn)展[20]。從臍帶 MSC 衍生的外泌體中釋放的 let-7f、miR-145、miR-199a 和 miR-221 在很大程度上有助于抑制丙型肝炎病毒[21]。miR-21 是一種抗凋亡 miRNA，在 MSC 外泌體中濃度最高。MSC 外泌體通過促進(jìn)肌生成和血管生成促進(jìn)肌肉再生，是由 miR-494 等 miRNA 介導(dǎo)的[10]。脂肪 MSC 外泌體中最豐富的 5 種 miRNA 是 miR-486-5p、miR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-191-5p 和 miR-222-3p；而骨髓 MSC 外泌體中 miR-143-3p、miR-10b-5p、miR-486-5p、miR-22-3p、miR-21-5p 占 miRNA 總量的 43% ~ 59%[22]。另外，外泌體也含有少量線粒體 DNA（mtDNA）、piRNA、長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNA）、核糖體 RNA（rRNA）、snRNA、snoRNA 和 tRNA[4]。

3 MSC 外泌體的獲取

3.1 離心法

為了開發(fā)外泌體在診斷和治療中的應(yīng)用，建立一個(gè)有效的方式來分離外泌體，且最小限度地改變它們的結(jié)構(gòu)和含量是十分必要的。目前公認(rèn)的黃金標(biāo)準(zhǔn)是差速超速離心。差速超速離心法利用不同蛋白質(zhì)分子及囊泡、細(xì)胞及細(xì)胞碎片等在均勻懸浮液中的沉降速度存在差異，通過逐漸增強(qiáng)離心力和離心時(shí)間來分離細(xì)胞、碎片和細(xì)胞器等，從而得到外泌體[23]。一般采用 300 ×離心 10 min，2000 ×離心10 min去除死亡細(xì)胞，10 000 ×離心 20 min 去除細(xì)胞碎片和大分子蛋白質(zhì)，100 000 ×離心 2 h 得到目的微球，然后用 0.22 μm 濾膜過濾除去凋亡小體和微囊。楊向榮等[24]將生長(zhǎng)良好的 P3至 P5臍帶 MSC 在 37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中使用無血清培養(yǎng) 48 h，收集上清液，4 ℃保存放置過夜，采用上述方法分離外泌體，在–80 ℃凍存。

高速離心法往往不能區(qū)分外泌體、小的囊泡以及部分蛋白質(zhì)，通常配合蔗糖密度梯度法提高外泌體純度。外泌體和其他所有脂質(zhì)囊泡一樣漂浮在蔗糖梯度中，其密度范圍從 1.13 g/ml（B 細(xì)胞來源外泌體）~ 1.19 g/ml（腸道細(xì)胞來源外泌體），凋亡細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)和核酸碎片等雜質(zhì)漂浮在蔗糖密度梯度中，經(jīng)高速離心分離達(dá)到純化的目的[23]。

目前，離心法提取外泌體還有待進(jìn)一步確立標(biāo)準(zhǔn)，不同的轉(zhuǎn)速、離心力、離心時(shí)間和樣本性質(zhì)均可能導(dǎo)致結(jié)果不同。

3.2 沉淀法

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）具有極強(qiáng)的親水性，可與疏水性的脂質(zhì)雙分子層結(jié)合，改變外泌體的溶解度或分散性使其沉淀?？梢杂糜谘?、血漿、腹水、尿液外泌體的分離，一般配合離心法和 0.22 μm 濾膜來提高外泌體的純度。梁亞會(huì)等[25]建立了一種利用 PEG 6000 溶液低速離心從骨髓 MSC 培養(yǎng)上清中分離外泌體的方法。將細(xì)胞培養(yǎng)上清于常溫 3000 ×離心 20 min，去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片，收集上清 0.22 μm 濾膜過濾除去大的顆粒及囊泡，加入 8% 5 × PEG 6000 試劑，4 ℃靜置過夜后，3000 ×離心 30 min，棄上清，離心管倒扣于吸水紙上風(fēng)干 5 ~ 10 min，根據(jù)沉淀的量加入適量的 PBS 重懸，再次 5000 ×離心 20 min，棄上清，根據(jù)獲得外泌體的量加入適量 PBS 重懸，即獲得骨髓 MSC 外泌體。

基于沉淀原理的試劑盒均加入了 PEG，先低速離心去除細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)顆粒，再加入試劑混合均勻，靜置一段時(shí)間后離心得到外泌體。郭瑩等[26]對(duì)差速離心法、Exo Quick 試劑盒法、Total Exosome Isolation 試劑盒法提取人臍帶 MSC 外泌體進(jìn)行比較，差速超速離心法提取的外泌體中的蛋白濃度和純度最高，Exo Quick 試劑盒法其次，Total Exosome Isolation 試劑盒法得到的蛋白濃度最低；但差速離心法和 Total Exosome Isolation 試劑盒法耗時(shí)長(zhǎng)。不同品牌的外泌體提取試劑盒的用法和用量都會(huì)存在差異，具體提取方法應(yīng)根據(jù)說明書進(jìn)行操作。

3.3 超濾法

超濾法是根據(jù)外泌體的大小使用相應(yīng)截流分子量的超濾膜，配合離心或加壓來分離外泌體。該法通過離心和壓力收集到的外泌體差異較大。近來，Lobb 等[27]指出，50 ~ 200 ml樣本更適合采用離心法，當(dāng)樣本量達(dá)到 400 ml 以上時(shí)更適合采用壓力法。胡國(guó)文等[28]采用旋轉(zhuǎn)超濾技術(shù)從骨髓 MSC 培養(yǎng)上清中分離外泌體。按離心法除去細(xì)胞碎片，以及 0.22 μm濾膜過濾后，將上清液加入裝有 100000NW-CO 超濾膜的 Model 8050 旋轉(zhuǎn)超濾儀中，接通氮?dú)猓⒆畲笸鈮毫刂圃?517.125 kPa 以下，打開磁力攪拌器，使漩渦高度為液體高度的 1/3，待上清液超濾完畢后，加入 50 ml PBS 再次超濾，重復(fù) 3 次。超濾完畢后，用 0.5 ml PBS 懸浮超濾膜上的外泌體，轉(zhuǎn)移至 EP 管中，放–80 ℃凍存?；谕饷隗w的粒徑、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)與物料間的相互作用力，采用凝膠滲透色譜柱能實(shí)現(xiàn)外泌體與雜質(zhì)的高效分離，但色譜柱不能反復(fù)多次使用，限制了該方法的發(fā)展[29]。

3.4 抗體親和捕獲法

用磁性粉末包被的單克隆抗體微顆粒，能與外泌體膜表面蛋白特異性結(jié)合。王靜等[30]用免疫磁珠法分選脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，使用 CD81 標(biāo)記的磁性微珠，與 PBS 和外泌體按一定比例混合，在 2 ~ 8 ℃條件下孵育過夜，第2 天離心收集管底沉淀，得到免疫磁珠-外泌體復(fù)合物，PBS 洗滌后可用于流式細(xì)胞檢測(cè)。

3.5 微流控技術(shù)分離法

微流控技術(shù)是 2012 年以后發(fā)展起來的外泌體分離新技術(shù)，可分為免疫親和、篩分、多孔結(jié)構(gòu)捕獲三類[31]。因其對(duì)小體積樣本的處理能力以及對(duì)生物顆粒的分離能力而引起廣泛關(guān)注，在生物醫(yī)學(xué)研究、分析化學(xué)、分子化學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[32]。免疫分離是通過表面帶有人字形凹槽的固定裝置，依賴于外泌體表面的受體，使其與裝置表面特異性抗體結(jié)合，再用適當(dāng)?shù)南疵撘合疵?，使其與其他脫落膜顆粒和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)分離。依據(jù) MSC 外泌體的表面標(biāo)記，可選擇相應(yīng)抗體進(jìn)行特異性收集。上述幾種分離外泌體方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較詳見表 2。

4 體外培養(yǎng)人 MSC 外泌體的臨床應(yīng)用研究

MSC 來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多功能干細(xì)胞，其具有多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)，是干細(xì)胞家族的重要成員，存在于骨髓、肝臟、脾臟、成人的骨骼肌、外周血、脂肪、韌帶、胎盤、臍帶、臍血、皮膚等組織中。2006 年國(guó)際間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)對(duì)人來源 MSC 實(shí)驗(yàn)研究提出 3 條最低鑒定標(biāo)準(zhǔn)：①在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，MSC 必須具備對(duì)塑料底物的貼附特性；②通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，MSC 群體表達(dá) CD105、CD73 及CD90 陽性率≥ 95%，且 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a 或 CD19、HLA-DR 的陰性表達(dá)率≥ 98%；③在體外，通過標(biāo)準(zhǔn)方法誘導(dǎo)，MSC 必須能向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化。

表 2 外泌體的分離方法比較

MSC 經(jīng)過體外培養(yǎng)后，細(xì)胞體積增大、歸巢能力降低以及移植入體內(nèi)的生存能力較差。使用外泌體進(jìn)行無細(xì)胞治療比基于干細(xì)胞的應(yīng)用提供了以下優(yōu)勢(shì)：①解決了可能與活細(xì)胞和增殖細(xì)胞群移植相關(guān)的若干安全隱患，包括免疫相容性、致瘤性、栓塞和感染傳播；②可以在不使用潛在毒性的冷凍保護(hù)劑的情況下長(zhǎng)期保存而不會(huì)喪失產(chǎn)品效力，即在儲(chǔ)存、處理和產(chǎn)品保質(zhì)期方面有更大的優(yōu)勢(shì)；③在受控的實(shí)驗(yàn)室條件下通過特定的細(xì)胞系可以大規(guī)模生產(chǎn)，且來自“好細(xì)胞”的外泌體攜帶許多 MSC 的再生蛋白；④外泌體符合納米顆粒的定義，體積相對(duì)較小，因此更容易穿過血腦屏障到達(dá)大腦的缺血區(qū)域或疾病位點(diǎn)；⑤外泌體中的內(nèi)容物可以通過不同的培養(yǎng)條件來控制，在未來的研究中，可以通過對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)施和修訂，以擴(kuò)增具有定制治療特性的 MSC 來源外泌體的產(chǎn)品[33]。

在北美臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心（http://clinicaltrials.gov）上可以檢索到與 MSC 來源外泌體相關(guān)的臨床試驗(yàn)有4 項(xiàng)，分別為評(píng)估其通過富集 miR-124 對(duì)急性缺血性腦卒中的治療作用、通過 miRNA-136,494,495 在外泌體內(nèi)的表達(dá)來提早預(yù)測(cè)子癇前期、比較 MSCs 及其來源外泌體對(duì)難治性黃斑裂孔的促愈合作用以及評(píng)估微泡和外泌體在治療 1 型糖尿病和 β-細(xì)胞缺失中的效果。除此之外，MSC 來源外泌體也運(yùn)用于靶向治療、載藥、組織修復(fù)、神經(jīng)疾病治療、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤抑制等方面[34]。研究表明，MSC 外泌體含有細(xì)胞因子和細(xì)胞因子生長(zhǎng)因子，如 TGFβ1、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-10 和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF），有助于免疫調(diào)節(jié)[11]。MSC 外泌體中還包括 VEGF、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)物（EMMPRIN）、MMP-9 這三種蛋白質(zhì)，對(duì)促血管生成起重要作用，也是組織修復(fù)的基礎(chǔ)。MSC 來源外泌體也是合適的遞藥系統(tǒng)，是天然的納米顆粒，且具有修飾的可塑性，人們還嘗試通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行外泌體表面修飾，提高組織靶向性和治療效果[35]。所以，外泌體的治療作用要廣泛的運(yùn)用于臨床，仍需要臨床試驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證和支持。

5 體外培養(yǎng)條件對(duì)人 MSC 外泌體的影響

臨床試驗(yàn)中可能需要數(shù)百微克至毫克的外泌體來治療患者，原代 MSC 數(shù)量很少，可以通過體外擴(kuò)增培養(yǎng)，控制培養(yǎng)微環(huán)境來增加外泌體的產(chǎn)量和誘導(dǎo)有效成分的高表達(dá)。目前常用的培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生 EVs 體系有 2D 培養(yǎng)體系、3D 培養(yǎng)體系（包括支架和無支架）和生物反應(yīng)器[36]。3D 培養(yǎng)體系可以彌補(bǔ)傳統(tǒng) 2D 培養(yǎng)體系在生理模式方面的缺失，但 3D 培養(yǎng)體系其支架組成會(huì)影響 EVs 的數(shù)量和質(zhì)量，且更難去評(píng)估，再現(xiàn)性和可伸縮性也應(yīng)該被考慮，EVs 的分離需要用酶進(jìn)行消化，會(huì)影響 EV 的完整性和生物活性。生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)在于 EV 的產(chǎn)量大，且在動(dòng)態(tài)條件下培養(yǎng)，可以增強(qiáng)生物反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)交換，但也必然會(huì)給 EV 的功能和特性帶來影響，例如，細(xì)胞接種的密度、老化程度、增殖代數(shù)、分化的不同時(shí)期、培養(yǎng)基基質(zhì)的形貌、剛性、流體剪切應(yīng)力以及周期性拉伸等細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境下的因素均會(huì)對(duì) EV 產(chǎn)生影響。細(xì)胞接種密度過大，會(huì)產(chǎn)生接觸抑制。長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)會(huì)加速 MSC 的老化，從而影響其可塑性和遺傳穩(wěn)定性，并反映在 EV 的內(nèi)容物上。細(xì)胞分化的不同階段分離出來的 EV 的 miRNA 的表達(dá)水平也不同。培養(yǎng)基質(zhì)的溝槽和脊線會(huì)影響 MSC 的擴(kuò)散和定向，使其朝向特定的譜系分化。培養(yǎng)基質(zhì)的剛性也會(huì)影響細(xì)胞的表型。除此之外，在缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞，會(huì)增加生長(zhǎng)因子和抗炎分子的產(chǎn)生[37]。Moon 等[38]通過腦缺血組織提取物（IBE）處理刺激 MSCs 釋放 EV，以模擬腦缺血生物化學(xué)微環(huán)境，可以成功獲得大量具有多種神經(jīng)源性和血管生成因子的 MSC 來源 EV，用于治療卒中。

6 問題與展望

人 MSC 外泌體可以用作無細(xì)胞成分的再生性藥物，主要是基于其質(zhì)量、復(fù)制性以及它們的制備過程，在同種方式下，這些參數(shù)也反映了基于人 MSC 治療的效果。因此，MSC 外泌體應(yīng)用于臨床仍存在以下問題：①外泌體成分并不是靜態(tài)的，是 MSC 活動(dòng)及其細(xì)胞間通訊所產(chǎn)生的，可被靶細(xì)胞內(nèi)化后，改變其生物學(xué)性能。在人 MSC 與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)或者處于體內(nèi)腫瘤微環(huán)境下，外泌體的成分也會(huì)發(fā)生改變。所以，在 MSC 外泌體的制備過程中，培養(yǎng)環(huán)境及參數(shù)決定了外泌體的生物學(xué)作用；②外泌體內(nèi)容物豐富，但具體的有效成分及作用機(jī)制仍待進(jìn)一步開發(fā)研究；③外泌體獲取方法差異性較大，需要進(jìn)一步優(yōu)化提高其產(chǎn)量和純度。總而言之，涉及MSC 來源外泌體質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議應(yīng)該被構(gòu)思并有效應(yīng)用于臨床，包括：①體外培養(yǎng) MSC 產(chǎn)生外泌體的定向培養(yǎng)方法及相關(guān)參數(shù)；②外泌體理想的純化獲取方法；③外泌體的物理特性和標(biāo)準(zhǔn)化表征；④外泌體中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和 miRNA 的分析標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，MSC 外泌體克服了細(xì)胞移植存在的問題，來源更廣，保存、運(yùn)輸更方便，能夠起到與干細(xì)胞相似的作用，且有望通過明確有效成分后，在培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)其特異性高表達(dá)，開發(fā)針對(duì)特定疾病的外泌體產(chǎn)品，使“無細(xì)胞”治療有望替代干細(xì)胞治療，成為干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向之一。

[1] B?rger V, Bremer M, G?rgens A, et al. Mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles as a new approach in stem cell therapy. ISBT Sci Ser, 2016, 11(S1):228-234.

[2] Kowal J, Tkach M, Théry C. Biogenesis and secretion of exosomes. Curr Opin Cell Biol, 2014, 29:116-125.

[3] Vlassov AV, Magdaleno S, Setterquist R, et al. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta, 2012, 1820(7):940- 948.

[4] Vakhshiteh F, Atyabi F, Ostad SN. Mesenchymal stem cell exosomes: a two-edged sword in cancer herapy. Int J Nanomedicine, 2019, 14:2847-2859.

[5] Frydrychowicz M, Kolecka-Bednarczyk A, Madejczyk M, et al. Exosomes - structure, biogenesis and biological role in non-small-cell lung cancer. Scand J Immunol, 2015, 81(1):2-10.

[6] Colombo M, Raposo G, Théry C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol, 2014, 30:255-289.

[7] Tan SS, Yin Y, Lee T, et al. Therapeutic MSC exosomes are derived from lipid raft microdomains in the plasma membrane. Journal of Extracellular Vesicles, 2013, 2(1):22614.

[8] Ghossoub R, Lembo F, Rubio A, et al. Syntenin-ALIX exosome biogenesis and budding into multivesicular bodies are controlled by ARF6 and PLD2. Nat Commun, 2014, 5:3477.

[9] Shao H, Im H, Castro CM, et al. New technologies for analysis of extracellular vesicles. Chem Rev, 2018, 118(4):1917-1950.

[10] Nakamura Y, Miyaki S, Ishitobi H, et al. Mesenchymal-stem-cell- derived exosomes accelerate skeletal muscle regeneration. FEBS Lett, 2015, 589(11):1257-1265.

[11] Yin S, Ji C, Wu P, et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells and exosomes: bioactive ways of tissue injury repair. Am J Transl Res, 2019, 11(3):1230-1240.

[12] Liu Z, Xu Y, Wang Y, et al. Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells prevent cardiomyocyte apoptosis induced by oxidative stress. Cell Death Discov, 2019, 5:79.

[13] Cheng L, Zhang K, Wu S, et al. Focus on mesenchymal stem cell-derived exosomes: opportunities and challenges in cell-free therapy. Stem Cells Int, 2017, 2017:6305295.

[14] Bobrie A, Colombo M, Raposo G, et al. Exosome secretion: molecular mechanisms and rolees in immune responses. Traffic, 2011, 12(12): 1659-1668.

[15] Beach A, Zhang HG, Ratajczak MZ, et al. Exosomes: an overview of biogenesis, composition and role in ovarian cancer. J Ovarian Res, 2014, 7:14.

[16] Deng H, Sun C, Sun Y, et al. Lipid, protein, and MicroRNA composition within mesenchymal stem cell-derived exosomes. Cell Reprogram, 2018, 20(3):178-186.

[17] Record M, Carayon K, Poirot M, et al. Exosomes as new vesicular lipid transporters involved in cell-cell communication and various pathophysiologies. Biochim Biophys Acta, 2014, 1841(1):108-120.

[18] Yu B, Zhang X, Li X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. Int J Mol Sci, 2014, 15(3):4142-4157.

[19] Z?ller M. Pancreatic cancer diagnosis by free and exosomal miRNA. World J Gastrointest Pathophysiol, 2013, 4(4):74-90.

[20] Lee JK, Park SR, Jung BK, et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells suppress angiogenesis by down-regulating VEGF expression in breast cancer cells. PLoS One, 2013, 8(12): e84256.

[21] Qian X, Xu C, Fang S, et al. Exosomal micrornas derived from umbilical mesenchymal stem cells nhibit hepatitis C virus infection. Stem Cells Transl Med, 2016, 5(9):1190-1203.

[22] Baglio SR, Rooijers K, Koppers-Lalic D, et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther, 2015, 6:127.

[23] Suchi G, Sonali R, Vivek A, et al. An improvised one-step sucrose cushion ultracentrifugation method for exosome isolation from culture supernatants of mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther, 2018, 9(1):180.

[24] Yang XR, Ding J, Xu ZY, et al. Biological characteristics of exosomes secreted by human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells. Acta Med Univ Sci Technol Huazhong, 2016, 45(2):154-159. (in Chinese)

楊向榮, 丁娟, 徐正陽, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體的生物學(xué)特性研究. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2016, 45(2):154-159.

[25] Liang YH, Guo ZK, Wang F, et al. A quick method of isolating exosomes from mesenchymal stem cells using PEG 6000. Med J Air Force, 2017, 33(3):176-179.(in Chinese)

梁亞會(huì), 郭子寬, 王芳, 等. PEG 6000快速提取間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體. 空軍醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 33(3):176-179.

[26] Guo Y, Wang XW, Niu YH, et al. Comparison of exosome extracting methods from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Chin J Tissue Eng Res, 2018, 22(9):1382-1388. (in Chinese)

郭瑩, 王秀偉, 牛玉虎, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體提取方法的比較. 中國(guó)組織工程研究, 2018, 22(9):1382-1388.

[27] Lobb RJ, Becker M, Wen SW, et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Ex-tracell Vesicles, 2015, 4:27031.

[28] Hu GW, Li Q, Niu X, et al. Stirring ultrafiltration: a new method for isolate exosomes. Acad J Second Milit Med Univ, 2014, 35(6):598- 602. (in Chinese)

胡國(guó)文, 李青, 牛鑫, 等. 旋轉(zhuǎn)超濾: 一種提取細(xì)胞外泌體的新方法. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 35(6):598-602.

[29] Koh YQ, Almughlliq FB, Vaswani K, et al. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed), 2018, 23:865-874.

[30] Wang J, Cai X, Wang ZG, et al. Isolation and identification of exosomes from human adipose-derived mesenchymal stem cells. Chin J Tissue Eng Res, 2019, 23(17):2651-2658. (in Chinese)

王靜, 蔡霞, 王志國(guó), 等. 分離與鑒定人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體. 中國(guó)組織工程研究, 2019, 23(17):2651-2658.

[31] Liga A, Vliegenthart AD, Oosthuyzen W, et al. Exosome isolation: a microfluidic road-map. Lab Chip, 2015, 15(11):2388-2394.

[32] Yang F, Liao X, Tian Y, et al. Exosome separation using microfluidic systems: size-based, immunoaffinity-based and dynamic methodologies. Biotechnol J, 2017, 12(4):1600699.

[33] Vizoso FJ, Eiro N, Cid S, et al. Mesenchymal stem cell secretome: toward cell-therapeutic strategies in regenerative mediciene. Int J Mol Sci, 2017, 18(9):E1852.

[34] Miceli V, Pampalone M, Vella S, et al. Comparison of immunosuppressive and angiogenic properties of human amnion-derived mesenchymal stem cells between 2D and 3D culture systems. Stem Cells Int, 2019, 2019:7486279.

[35] Cheng L, Zhang K, Wu S, et al. Focus on mesenchymal stem cell-derived exosomes: opportunities and challenges in cell-free therapy. Stem Cells Int, 2017, 2017:6305295.

[36] Patel DB, Santoro M, Born LJ, et al. Towards rationally designed biomanufacturing of therapeutic extracellular vesicles: impact of the

bioproduction microenvironment. Biotechnol Adv, 2018, 36(8):2051- 2059.

[37] Vitha AE, Kollefrath AW, Huang CC, et al. Characterization and therapeutic uses of exosomes: a new potential tool in orthopedics. Stem Cells and Dev, 2018, 28(2):141-150.

[38] Moon GJ, Sung JH, Kim DH, et al. Application of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for stroke: biodistribution and microRNA study. Transl Stroke Res, 2018. [Epub ahead of print]

劉馨，Email：fluidstar@126.com

2019-05-22

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.013