龐慧芳，范學科，滿 泉，李 鵬

(1.通遼市醫(yī)院消化內鏡中心，內蒙古 通遼 028000； 2.晉城市人民醫(yī)院消化內科，山西 晉城 048000； 3.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院消化內科，北京 100050)

胰腺癌是一種起病隱匿、發(fā)展迅速且病死率較高的惡性腫瘤，其早期診斷困難，治療效果不佳[1]。近年來，各種體內體外研究結果表明，姜黃素可以抑制包括胰腺癌在內的多種腫瘤細胞的生長，其主要通過抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移，促進腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤效應[2-9]。但是，姜黃素誘導胰腺癌細胞凋亡的機制尚不完全清楚。本研究以不同濃度姜黃素處理胰腺癌PANC-1細胞，觀察姜黃素對該細胞增殖與凋亡的影響，進一步檢測凋亡相關基因含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9及B淋巴細胞瘤-2基因相關X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax)的表達變化，探討姜黃素對胰腺癌的抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌細胞株PANC-1細胞(同濟醫(yī)院肝病研究所提供)；RPMI-1640高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；姜黃素(純度>95%)(美國Sigma公司)；細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(武漢鼎國生物公司)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；Real-time PCR逆轉錄試劑盒、SYBR Green Real-time PCR Master Mix(日本Takara公司)，PCR引物(上海生工合成)；Western凝膠試劑盒(武漢博士德生物公司)；Caspase-3、Caspase-9兔抗人單克隆抗體(美國Proteintech公司)；β-肌動蛋白兔抗人單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(武漢谷歌生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測姜黃素對人胰腺癌PANC-1細胞增殖的影響：(1)取對數(shù)生長期的人胰腺癌PANC-1細胞，用0.25%胰酶消化后，制成5×104個/ml單細胞懸液，以每孔200 μl細胞懸液接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(2)經培養(yǎng)24 h貼壁達70%融合度時，棄掉舊培養(yǎng)基，分別設實驗組、陰性對照組、空白組0和空白組1。實驗組用10、20、40、60、80、100 μmol/L濃度的姜黃素處理；陰性對照組為單純培養(yǎng)基處理；空白組0為未接種細胞的單純培養(yǎng)基；另設相應濃度姜黃素的培養(yǎng)基為空白組1。以上每孔均設4個平行復孔，體積調整為100 μl，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。(3)實驗終止后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，輕輕搖晃混勻后用錫箔紙包裹培養(yǎng)板，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀于450 nm波長檢測各孔光密度(OD)值。(4)計算人胰腺癌PANC-1細胞各實驗組相對增殖率，分析藥物濃度和處理時間對人胰腺癌PANC-1細胞增殖的影響。細胞相對增殖率=(實驗組OD值-空白組1 OD值)/(陰性對照組OD值-空白組0 OD值)×100%。

1.2.2 流式細胞儀檢測姜黃素對人胰腺癌PANC-1細胞凋亡的影響：(1)將PANC-1細胞以3×105/每孔接種于6孔板。(2)細胞貼壁達80%融合度時經0、10、20、40 μmol/L濃度的姜黃素處理，設3個復孔，48 h后用倒置相差顯微鏡觀察細胞凋亡情況并拍照記錄。(3)收集并胰酶消化，1 000 r/min離心5 min后再用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清并收集2×105個細胞。(4)加入 1×Binding Buffer懸浮細胞500 μl后，先后加入Annexin V-FITC 5 μl及碘化丙碇5 μl混勻。(5)室溫(24～26 ℃)、避光及反應10 min后，在1 h內采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.3 實時聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)法檢測姜黃素對Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bax的信使RNA(mRNA)表達變化的影響：(1)將人胰腺癌PANC-1細胞以每孔3×105接種于6孔板，融合度達80%時，用0、10、20、40 μmol/L濃度的姜黃素處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后使用Trizol法提取細胞總RNA并測定濃度。(2)采用TaKaRa逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為互補DNA(cDNA)，使用SYBR Green試劑盒配制聚合酶鏈反應液，在StepOne Real-time PCR systems(ABI，USA)上按反應條件進行RT-PCR反應。每組設3個復孔，設β-肌動蛋白為內參。用2-ΔΔCT法計算分析RT-PCR數(shù)據(jù)，比較各組基因表達的相對差異。

1.2.4 蛋白質印跡法(Western Blot法)檢測姜黃素對Caspase-3、Caspase-9蛋白表達變化的影響：(1)將人胰腺癌PANC-1細胞以每孔3×105接種6孔板，用0、10、40 μmol/L姜黃素處理48 h后提取細胞總蛋白。(2)測定蛋白濃度并常規(guī)變性處理，進行電泳、轉膜、孵育一抗Caspase-3、Caspase-9、β-肌動蛋白與辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG。(3)增強化學發(fā)光法顯色后，用BioDoc-It 220凝膠成像系統(tǒng)和Image J分析軟件對圖像條帶作半定量分析，并比較各組蛋白表達變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 姜黃素對人胰腺癌PANC-1細胞增殖的影響

CCK-8法結果顯示，隨著姜黃素作用濃度的逐漸提高，人胰腺癌PANC-1細胞增殖率逐漸降低；并且，隨著處理時間的延長，其增殖抑制效應更加顯著，上述差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明姜黃素對人胰腺癌PANC-1細胞具有較強的增殖抑制作用，且呈劑量和時間依賴性，見表1、圖1。

表1 姜黃素對人胰腺癌PANC-1細胞相對增殖率的影響Tab 1 Effect of curcumin on the relative proliferation rate of pancreatic cancer PANC-1

注：與對照組比較，*P<0.05；與24 h組比較，▲P<0.05；與48 h組比較，#P<0.05

Note:vs. control group,*P<0.05; vs. 24 h group,▲P<0.05; vs. 48 h group,#P<0.05

圖1 姜黃素對人胰腺癌PANC-1細胞相對增殖率的影響Fig 1 Effect of curcumin on the relative proliferation rate of pancreatic cancer PANC-1 cells

2.2 姜黃素對人胰腺癌PANC-1細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組相比，實驗組經姜黃素處理的人胰腺癌PANC-1細胞的凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖2(A—B)；并且，當姜黃素濃度在0～20 μmol/L時，隨著濃度增高，細胞凋亡率逐漸升高，但當濃度達40 μmol/L時細胞凋亡率反而降低，細胞壞死率卻顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但正常細胞總數(shù)仍最低。這說明姜黃素對人胰腺癌PANC-1細胞不僅具有促進凋亡作用，而且具有一定的細胞毒性作用。倒置相差顯微鏡下，隨著姜黃素濃度的增加，人胰腺癌PANC-1細胞的凋亡現(xiàn)象更加顯著。與對照組比較，姜黃素40 μmol/L組細胞總數(shù)大量減少，并出現(xiàn)細胞皺縮且體積變小，細胞變圓，細胞間的緊密連接變得松散，上清液中可見大量漂浮的凋亡細胞，發(fā)生典型的細胞凋亡現(xiàn)象，即出現(xiàn)凋亡小體，見圖2(C)。

表2 姜黃素對胰腺癌PANC-1細胞凋亡率的影響Tab 2 Effect of curcumin on the apoptosis rate of pancreatic

注：與對照組比較，*P<0.05，#P>0.05

Note: vs. control group,*P<0.05,#P>0.05

A.PANC-1細胞分布經0、10、20及40 μmol/L姜黃色處理48 h后流式細胞儀檢測圖；B.PANC-1細胞凋亡率及壞死率的變化(與對照組比較，*P<0.05，#P>0.05)；C.40 μmol/L姜黃素處理PANC-1細胞48 h后相差顯微鏡下凋亡形態(tài)學變化(×200)A.flow cytometry of PANC-1 cells distribution after processing by 0, 10, 20 and 40 μmol/L of curcumin for 48 hours; B.changes of apoptosis rate and necrosis rate of PANC-1 (vs. control group, *P<0.05, #P>0.05); C.morphological changes of apoptosis of PANC-1 cells under phase contrast microscope after processing by 40 μmol/L of curcumin for 48 hours (×200)圖2 姜黃素對胰腺癌PANC-1細胞凋亡的影響Fig 2 Effect of curcumin on the apoptosis of pancreatic cancer PANC-1 cells

2.3 姜黃素對人胰腺癌PANC-1細胞凋亡相關基因表達的影響

2.3.1 人胰腺癌PANC-1細胞Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8及Bax的mRNA表達變化：RT-PCR法結果顯示，實驗組人胰腺癌PANC-1細胞Caspase-3、Caspase-9基因mRNA表達水平較對照組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著姜黃素濃度增高，其表達量具有遞增趨勢(F=1 960.106，P=0.000；F=1 938.118，P=0.000)；Caspase-8及Bax基因mRNA表達水平在姜黃素濃度為0～20 μmol/L時具有遞增趨勢，但在40 μmol/L時反而降低接近基礎水平；Bax基因mRNA表達水平的組間差異有統(tǒng)計學意義(F=24.796，P=0.000)；姜黃素濃度為10、20 μmol/L時，Caspase-8基因mRNA表達水平的差異有統(tǒng)計學意義(F=95.212，P=0.000)，姜黃素濃度為40 μmol/L時與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3(A)。

2.3.2 人胰腺癌PANC-1細胞Caspase-3、Caspase-9的蛋白表達變化：Western blot法結果顯示，與對照組比較，實驗組人胰腺癌PANC-1細胞Caspase-3、Caspase-9基因的蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(F=50.790，P=0.000；F=399.717，P=0.000)；姜黃素濃度達到40 μmol/L時，Caspase-3基因的蛋白表達則無明顯升高趨勢，與20 μmol/L時的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這與mRNA水平并不完全相符；Caspase-9蛋白水平的升高趨勢較顯著，實驗組各濃度組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，基本符合該基因的轉錄水平變化，見圖3(B—C)。

A.Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8及Bax的mRNA表達變化(與對照組比較，*P<0.05，#P>0.05)；B.Caspase-3、Caspase-9的蛋白條帶圖；C.Caspase-3、Caspase-9的蛋白表達變化(與對照組比較，*P<0.05)A.changes of mRNA expressions of Caspase-3, Caspase-9,Caspase-8 and Bax (vs. control group, *P<0.05, #P>0.05); B.histogram of protein of Caspase-3 and Caspase-9; C.changes of protein expression of Caspase-3 and Caspase-9 (vs. control group, *P<0.05)圖3 姜黃素對胰腺癌PANC-1細胞凋亡相關基因表達的影響Fig 3 Effect of curcumin on the expression of apoptosis-related gene in pancreatic cancer PANC-1 cells

3 討論

姜黃素為一種天然多酚類化合物，其預防腫瘤、抗腫瘤及增強惡性腫瘤放化療敏感性的作用在多種腫瘤細胞中得到了證實[10-11]。本實驗選用中藥姜黃素為研究對象，觀察該藥對體外培養(yǎng)的人胰腺癌PANC-1細胞的抗腫瘤效應。本研究結果顯示，姜黃素能夠顯著抑制人胰腺癌PANC-1細胞的增殖，促進其凋亡，二者均呈劑量依賴性(P<0.05)；經姜黃素處理的實驗組細胞鏡下可見皺縮變圓、體積變小，發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學改變。該結果與國內外相關研究結果基本一致[12-14]。與對照組比較，雖然實驗組人胰腺癌PANC-1細胞的凋亡率及壞死率明顯升高，但當姜黃素濃度提高至40 μmol/L時其凋亡率降低，壞死率卻顯著升高，活細胞率仍最低。這說明姜黃素對人胰腺癌PANC-1細胞不僅具有促進凋亡作用，還具有一定程度的細胞毒性殺傷作用。

為進一步闡明姜黃素誘導人胰腺癌PANC-1細胞的凋亡機制，本研究采用RT-PCR法，從RNA水平檢測姜黃素對人胰腺癌PANC-1細胞凋亡關鍵因子Caspase家族及Bax基因的表達變化。結果提示，實驗組各姜黃素濃度組細胞的Caspase-3、Caspase-9基因mRNA表達水平較對照組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著姜黃素濃度增高其表達量具有遞增趨勢。該結果表明，姜黃素對人胰腺癌細胞的凋亡機制主要通過誘導Caspases家族基因而介導，其中內源性途徑占主導地位。另外，內源性凋亡途徑主要受B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白調控，Bax是Bcl-2家族中最重要的促凋亡因子。本研究中，姜黃素能夠上調Bax mRNA的表達。因此，姜黃素對體外胰腺癌細胞通過抑制其增殖和促進其凋亡而起到抗腫瘤效應，其促凋亡的分子機制主要通過凋亡執(zhí)行蛋白Caspases家族基因與凋亡調控蛋白Bcl-2家族的調節(jié)而介導?？傊?，姜黃素可能通過內源、外源2條途徑激活Caspases家族基因而誘導人胰腺癌細胞凋亡，但以內源性凋亡途徑為主導，二者相互影響，相互作用。