鄒敬宇，班允超，徐曉鶴，包義君，吳安華

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽(yáng) 110001； 2. 附屬盛京醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110004）

阿爾茨海默病 （Alzheimer disease，AD） 是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］，占癡呆病例的60%～70%［2］，目前公認(rèn)的病理生理特征為淀粉樣蛋白的沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡［3］。然而，認(rèn)知能力與斑塊的積累并非總是密切相關(guān)［4］。無(wú)論是AD患者還是AD模型小鼠，在淀粉樣蛋白斑塊出現(xiàn)之前，通常就已經(jīng)出現(xiàn)了學(xué)習(xí)能力的損害［5］。越來(lái)越多的研究［6］表明，在形成淀粉樣沉積前，可溶性的β-淀粉樣蛋白 （amyloid β-protein，Aβ） 在AD的病理進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，尤其是AD早期階段。腦外傷 （traumatic brain injury，TBI） 是導(dǎo)致AD的危險(xiǎn)因素［7］，并且可以加速AD的病理進(jìn)程，降低AD的發(fā)病年齡［8］。有研究［9］表明，TBI或運(yùn)動(dòng)相關(guān)的腦損傷可加速AD樣神經(jīng)病理學(xué)的改變。與無(wú)損傷的大腦相比，受損的大腦內(nèi)不溶性Aβ沉積物更多。在3xTg-AD模型小鼠中，TBI小鼠提前出現(xiàn)了AD樣病理學(xué)的改變［10］。而TBI是否可導(dǎo)致可溶性Aβ增加，從而導(dǎo)致行為學(xué)改變以及突觸和神經(jīng)元功能受損，尚無(wú)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：20只C57BL/6雄性小鼠（WT），20只三轉(zhuǎn)基因APP/PS1/tau雄性小鼠 （3xTg） ，4～5月齡，由日本金澤醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)Ⅰ實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。各隨機(jī)分為2組 （n = 10） ，分別標(biāo)記為WT組和3xTg組。距前囟和頂枕點(diǎn)連線中點(diǎn)左右兩側(cè)2.0 mm處，用直徑為0.6 mm的電鉆鉆開(kāi)顱骨，使用漢密爾頓1 μL注射器，在雙側(cè)皮質(zhì)表面以下1.0 mm處注入0.25 μmol/L谷氨酸鈉 （glutamate，Glu） 或生理鹽水0.2 μL。

1.1.2 主要試劑及儀器：Glu，Morris水迷宮及視頻軟件，震蕩切片機(jī)，玻璃電極控制儀，恒流泵，恒溫浴槽，電子天平，生理信號(hào)采集記錄分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：本研究采用經(jīng)典Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法［11］。應(yīng)用圓形恒溫水池 （直徑150 cm，高50 cm） ，水溫 （25±1） ℃；在第2象限正中放置直徑9 cm、低于水面1 cm的圓形平臺(tái)，距離水池邊緣約30 cm，各象限的池壁中點(diǎn)處上方分別放置紅、綠、藍(lán)、黃色的模型作為小鼠尋找平臺(tái)的參照物。實(shí)驗(yàn)期間，保持圓形平臺(tái)和4個(gè)參照物的位置不變。

連續(xù)5 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，每日下午1次，在4個(gè)象限中點(diǎn)處作為入水點(diǎn)，將小鼠面向池壁置入水中，記錄1 min內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間，如1 min內(nèi)小鼠仍未找到平臺(tái)，則將小鼠人為放置于平臺(tái)，停留1 min。每次入水實(shí)驗(yàn)間隔休息30 s，將小鼠拭干。在第5天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤去平臺(tái)，設(shè)置同樣的參數(shù)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，任選一處入水，測(cè)量小鼠穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)，停留時(shí)間及游動(dòng)距離。尾靜脈注射，7 d后再進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。第1組小鼠完成注射2周后行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。另一組小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行注射，2周后進(jìn)行第2次水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 小鼠海馬腦片細(xì)胞外記錄場(chǎng)興奮性突觸后電 位 （field exciatatory postsynaptic potential，fEPSP）：配置好使用的人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF） 和切片液，裝有切片的燒杯至于冰水混合物中，小鼠斷頭取腦，置入切片液中5 min，取出腦組織，分離海馬及相連皮質(zhì)，用低濃度瓊脂將組織固定于備好的瓊脂塊膠皿中，切片液倒入膠皿，將膠皿固定在振動(dòng)切片機(jī)，腦片厚度400 μm，將切好的腦片置入ACSF中，所有操作均通氧氣。使用恒流泵建立有氧的ACSF循環(huán)。腦片轉(zhuǎn)至記錄槽固定，刺激電極置于CA3區(qū)錐體細(xì)胞schaffer側(cè)支，記錄電極（充以1 mol/L NaCl玻璃微電極） 置于CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突層130～200 μm。設(shè)置參數(shù)，刺激電壓為引起最大fEPSP的30%，基礎(chǔ)fEPSP穩(wěn)定30 min，穩(wěn)定后記錄5 min，改為T(mén)BS參數(shù)，TBS后改為原參數(shù)記錄fEPSP，如PS增幅＞20%，持續(xù)30 min，視為L(zhǎng)TP誘發(fā)成功。

1.3 可溶性Aβ1-42的測(cè)定

斷頭取腦，液氮凍存游離的海馬組織，按腦質(zhì)量加入相當(dāng)體積的生理鹽水，用勻漿器將組織研磨，在冰浴下超聲波粉碎制成勻漿，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。上清液用1 mol/L Tris稀釋20倍，中和PH。采用BNT-77/BC-05夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書(shū) （日本W(wǎng)ako Chemical Ltd公司）進(jìn)行操作。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：試劑盒標(biāo)準(zhǔn)溶液 （人Aβ1-42） 20 pmol/L，然后獲得每個(gè)腦組織的Aβ1-42的濃度（pmol·L-1·g-1） 。對(duì)于每個(gè)樣品，重復(fù)測(cè)量2次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用表示，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測(cè)試

與3xTg小鼠相比，WT小鼠逃避潛伏期顯著縮短 （P ＜ 0.01，表1） ，將WT和3xTg小鼠每組再分為平均成績(jī)幾乎相同的2組，分別注射谷氨酸鈉 （WT+G組和3xTg +G組） 和生理鹽水 （WT+S組和3xTg +S組） 。與3xTg+S組小鼠相比，3xTg+G組小鼠逃避潛伏期顯著增加 （P ＜ 0.05，表2） ，3xTg+G組小鼠 1 min內(nèi)在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間比例（40.64%±1.36%） 顯著低于3xTg+S組小鼠 （48.56%±1.63%） （P ＜ 0.05，n = 10） 。而WT+S組小鼠與WT+G組小鼠的逃避潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P ＞ 0.05，表2） ；WT+S組小鼠（53.74%±1.24%） 與WT+G組小鼠 （51.58%±1.46%）1 min內(nèi)在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P ＞ 0.05，n = 10） 。

2.2 各組海馬fEPSP斜率

表1 各組小鼠逃避潛伏期 （ ，n = 10）Tab.1 Escape latency of mice in each group （ ，n = 10）

表1 各組小鼠逃避潛伏期 （ ，n = 10）Tab.1 Escape latency of mice in each group （ ，n = 10）

Compared with 3xTg mice，1） P ＜ 0.05；2） P ＜ 0.01.

?

表2 Glu對(duì)各組小鼠逃避潛伏期的影響 （，n = 10）Tab.2 Effect of glutamate on escape latency of mice in each group （，n = 10）

表2 Glu對(duì)各組小鼠逃避潛伏期的影響 （，n = 10）Tab.2 Effect of glutamate on escape latency of mice in each group （，n = 10）

Compared with 3xTg+G group，1） P ＜ 0.05.

?

各組高頻強(qiáng)直刺激后成功誘發(fā)LTP，持續(xù)記錄30 min。3xTg+S組小鼠fEPSP斜率明顯高于3xTg+G組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。WT+G組小鼠與WT+S組小鼠fEPSP相比，斜率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞ 0.05） ，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠高頻強(qiáng)直電刺激前后海馬CA1區(qū)fEPSP相對(duì)最大斜率的比較

2.3 DNA微陣列分析

從每組隨機(jī)選出3只小鼠并取出雙側(cè)海馬，進(jìn)行DNA微陣列分析。注射生理鹽水的組與注射Glu的組相比，有3個(gè)基因的表達(dá)增加了2倍以上 （P ＜ 0.05，n = 3） ，1個(gè)基因下調(diào)2倍以上 （P ＜ 0.05，n = 3） 。見(jiàn)表3。

2.4 海馬組織內(nèi)可溶性Aβ1-42測(cè)定

為了驗(yàn)證Glu可能導(dǎo)致海馬內(nèi)Aβ1-42增加，從而導(dǎo)致3xTg小鼠的學(xué)習(xí)能力惡化，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)比較了3xTg+G組小鼠和3xTg+S組小鼠海馬可溶性Aβ1-42含量。結(jié)果表明，3xTg+G組 （6.037 pmol·L-1·g-1） 海馬內(nèi)可溶性Aβ1-42顯著高于3xTg+S組 （4.327 pmol·L-1·g-1，t = 2.776，P = 0.020） 。

3 討論

已有研究［12］顯示，TBI可加速Aβ斑塊的沉積，從而加速其認(rèn)知功能的損害，然而，TBI是否在早期即引起可溶性Aβ增加，從而引起認(rèn)知功能的損害，目前尚無(wú)報(bào)道［13］。因此，近來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者將目光集中到了AD早期細(xì)胞內(nèi)可溶性Aβ的相關(guān)研究。

本研究以4～5月齡的3xTg-AD模型小鼠為研究對(duì)象，該月齡小鼠特點(diǎn)為可溶性Aβ已在細(xì)胞內(nèi)聚集，而細(xì)胞外Aβ斑塊尚未沉積。結(jié)果表明，Glu誘導(dǎo)的微小皮質(zhì)損傷能夠損害3xTg-AD模型小鼠空間學(xué)習(xí)能力。

通過(guò)1次傳統(tǒng)的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，將3xTg小鼠分為成績(jī)相同的2組，同時(shí)將WT小鼠也分為成績(jī)相同的2組，分別進(jìn)行Glu損傷注射和生理鹽水對(duì)照注射，而后進(jìn)行重復(fù)的Morris實(shí)驗(yàn)表明，3xTg+S組的學(xué)習(xí)記憶能力明顯優(yōu)于3xTg+G組。而WT+S組與WT+G組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 各組小鼠海馬組織DNA微陣列分析結(jié)果 （n = 3）Tab.3 Results of DNA microarray analysis in hippocampi of mice in each group （n = 3）

為了驗(yàn)證Glu誘導(dǎo)3xTg小鼠學(xué)習(xí)能力惡化的原因，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)比了3xTg+G組和3xTg+S組小鼠海馬組織中可溶性Aβ1-42含量，結(jié)果表明，3xTg+G組學(xué)習(xí)能力的下降可能與海馬組織中可溶性Aβ1-42含量的增加有關(guān)。

本研究中，海馬并未直接受到注射損傷，故推斷注射損傷可能產(chǎn)生了某些因子并傳遞到海馬組織，而Glu引起海馬內(nèi)可溶性Aβ1-42含量增高，可能也由這些因子造成，因此本研究進(jìn)行了DNA微陣列分析。結(jié)果表明，與生理鹽水對(duì)照組相比，Glu注射組海馬組織的Prg4，4833420G17Rik，Arhgef10基因表達(dá)增加了2倍以上 （P ＜ 0.05） ，Upk1b基因表達(dá)下降了2倍以上 （P ＜ 0.05） ，但它們是否與Aβ的增殖和清除存在直接關(guān)聯(lián)目前尚無(wú)報(bào)道。因此，這些“可移動(dòng)的”因子還有待進(jìn)一步研究。

顱腦損傷與AD的相互作用還存在很多未知因素，微小顱腦損傷可能加快AD臨床前期的發(fā)展速度。神經(jīng)細(xì)胞凋亡可上調(diào)皮質(zhì)中某種因子的表達(dá)，該因子通過(guò)某種途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至海馬組織中，激活A(yù)β42產(chǎn)生的循環(huán)通路，啟動(dòng)小鼠認(rèn)知功能障礙。未來(lái)將通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡—某因子—Aβ42—小鼠認(rèn)知功能障礙之間的內(nèi)在機(jī)制。