孫精文，張蕊，李艷

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，沈陽 110001）

急性髓系白血病 （acute myeloid leukemia，AML）是一組以造血干細(xì)胞增殖失控，分化受阻，同時抑制正常造血為特點的異質(zhì)性造血系統(tǒng)惡性疾病。近年來，隨著基因組研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)的修飾作用，如DNA甲基化狀態(tài)的改變，特別是抑癌基因啟動子的甲基化，引起抑癌基因沉默，是影響白血病發(fā)生和發(fā)展的重要分子機(jī)制［1］。表觀遺傳修飾是指不涉及DNA序列改變的一種可逆的、動態(tài)的及可隨細(xì)胞分裂而遺傳的基因調(diào)節(jié)方法［2］。DNA甲基化是目前表觀遺傳學(xué)最主要及常見的基因轉(zhuǎn)錄前調(diào)控機(jī)制［3-4］，出現(xiàn)在不同的疾病中，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［5］、淋巴細(xì)胞白血?。?］和AML［7］。已有文獻(xiàn)［8］中，大約50%的AML患者缺乏細(xì)胞遺傳學(xué)異常，處于中度風(fēng)險組，而很大比例的患者攜帶未知AML相關(guān)調(diào)控基因［9-10］。因此，關(guān)于AML的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，表觀遺傳學(xué)修飾機(jī)制比只用體內(nèi)突變來解釋更合理。

Ras/MAPK信號通路已被證實參與AML的發(fā)病機(jī) 制， SPRED1 （human sprout-related EVH1 domaincontaining 1） 是 參 與 調(diào) 控AML Ras/MAPK信 號 通路的抑癌基因［11-12］。SPRED1于2001年由YOSHIMURA等［13］在鼠的破骨細(xì)胞cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)。SPRED1位于染色體15q13.2，編碼含有444個氨基酸的蛋白質(zhì)，具有3個功能域，即N端的EVH1域、中間的c-kit結(jié)合域和C端的SPRY相關(guān)域，與SPRED2、SPRED3同屬于SPRED家族［14］。人類SPRED1在肺、腦、脊髓、腎臟和乳腺中高表達(dá)，在肝、胰腺、前列腺、甲狀腺、肌肉、骨骼、骨髓中表達(dá)相對較低［15-17］。SPRED1與神經(jīng)纖維蛋白1 （protein-neurofibromin，NF1） 相互作用，下調(diào)Ras/MAPK信號通路［14］。在肝細(xì)胞癌、前列腺癌和淋巴瘤中，SPRED1可抑制Ras/MAPK信號通路和惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移。另外，SPRED1已被證實在兒童急性白血病中下調(diào)，是Ras/MAPK信號通路的抑癌基因［12］。然而SPRED1的下調(diào)機(jī)制目前仍未知。研究［18］發(fā)現(xiàn)，伴有SPRED1突變者具有白血病傾向，但后續(xù)研究［12，19］表明，SPRED1突變和缺失在AML并不常見。本研究擬探討AML患者SPRED1的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)，分析其與SPRED1 mRNA水平和預(yù)后參數(shù)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選擇2015年10月至2017年6月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院的AML患者共50例 （病例組） ，其中，男27例，女23例，年齡16～80歲 （中位年齡45歲）。所有患者依據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織AML分型標(biāo)準(zhǔn)［20］進(jìn)行診斷、分型。對照組為20例健康志愿者，年齡18～75歲 （中位年齡54歲）。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn) （#AFSOP-07-1.0-01） 以及研究對象和家屬的知情同意。

1.1.2 主要試劑：AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒［康寧生命科學(xué) （吳江） 有限公司］； M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒 （美國Promega公司）；Trizol試劑盒、SYBR GREEN試劑盒、單鏈cDNA合成試劑盒 （日本TaKaRa公司）；EZ DNA Methylation-Gold Kit、熱啟動的DNA聚合酶 （美國Zymo公司）。

1.1.3 主要儀器：NanoDropTM 2000分光光度計 （美國Thermo公司）；PCR儀 （7500，美國ABI公司）；K960熱循環(huán)儀 （杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）；低溫高速離心機(jī) （德國Eppendorf公司）；MassARRAY平臺 （美國Sequenom公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及實時熒光定量PCR：抽取骨髓樣本，用Trizol試劑盒從骨髓樣本的單個核細(xì)胞中提取RNA，紫外分光光度儀檢測A260/A280均為1.8～2.0，以確定其濃度與純度。用單鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。行實時定量PCR，β-actin為內(nèi)參照基因。PCR引物由Invitrogen公司合成，SPRED1正義引物序列為5'-GATGAGCG AGAGACGGAGAC-3'，反義引物序列為5'-GTCTCT GAGTCTCTCCACGGA-3'；β-actin正 義 引 物 序 列為5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，反義引物序列為5'-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3'。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。隨后進(jìn)行熔解曲線的獲取和分析，以確定PCR反應(yīng)的特異性。SPRED1的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計算。

1.2.2 DNA的提取及甲基化定量PCR：用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒從骨髓樣本的單個核細(xì)胞中提取DNA，紫外分光光度儀檢測A260/A280均為1.8～2.0。所有DNA立即硫化修飾處理或-20 ℃保存?zhèn)溆?。參照EZ DNA Methylation Kit說明書，對抽提的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，在MassARRAY平臺進(jìn)行DNA甲基化的定量檢測。應(yīng)用Sequenom EpiDesigner software （www.epidesigner.com） 設(shè)計引物，正義引物序列為5'-AGGATAATGTTGTTGTTGAGGTAGGagga agagag-3'，反義引物序列為5'-CTAAATCCCAAATA CTCCCAAATTCcagtaatacgactcactatagggagaaggct-3'。反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，64 ℃ 30 s，72 ℃1 min，40個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism軟件 （version 5.0，美國GraphPad Software公司） 進(jìn)行統(tǒng)計分析及數(shù)據(jù)繪圖。采用Mann-Whitney檢驗評估病例組與對照組之間的SPRED1基因啟動子甲基化差異，采用Spearman相關(guān)系數(shù)r評估SPRED1基因啟動子甲基化狀態(tài)與mRNA水平和預(yù)后參數(shù)之間的相關(guān)性。所有檢驗均設(shè)定為雙側(cè)檢驗，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平顯著升高

SPRED1基因 （#1：310-723 bp） 包含12個CpG位點 （圖1A），用Sequenom MassARRAY平臺分析50例AML患者和20例健康對照的甲基化水平。分析之前，進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，刪除潛在的不可靠的測量數(shù)據(jù)［21］，包括少于30%的樣本檢測到的CpG位點（unreliable CpG units） 和丟失數(shù)據(jù)超過30%的樣本（unreliable samples），最后所獲得的有效CpG位點為9個。

#1_CpG_1在AML患者中的甲基化水平 （86.94%±8.61%） 明顯高于健康對照組 （82.70%±2.85%，P ＜0.01）；#1_CpG_2在AML患者中的甲基化水平 （86.18%±29.40%） 明顯高于健康對照組 （80.90%±28.98%，P = 0.031）；#1_CpG_11在AML患者中的甲基化水平（88.68%±15.38%） 高于健康對照組 （86.00%±7.71%，P = 0.039，圖1B），其他位點在AML病例組和健康對照組中均無統(tǒng)計學(xué)差異 （P ＞ 0.05）。

圖1 AML患者與健康對照組SPRED1啟動子甲基化水平的比較Fig.1 Comparison of SPRED1 gene promoter methylation levels between control individuals and patients with AML

2.2 AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平與SPRED1 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)

AML患者的SPRED1 mRNA水平 （0.92±2.73） 明顯低于健康對照組 （1.77±4.79，P ＜ 0.01）。在AML患者中，#1_CpG_11甲基化水平與SPRED1 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān) （r = -0.427，P = 0.004） （圖2A）；#1_CpG_2、#1_CpG_1甲基化水平與SPRED1 mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性 （r = -0.033，P = 0.822；r = -0.005，P =0.972） （圖2B、2C）。

2.3 SPRED1基因啟動子甲基化水平與AML患者的預(yù)后參數(shù)缺乏相關(guān)性

圖2 AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平與SPRED1 mRNA水平的相關(guān)性Fig.2 Correlation between SPRED1 gene promoter methylation level and SPRED1 mRNA expression level in AML patients

分析SPRED1#1_CpG_11甲基化水平與一系列AML患者預(yù)后相關(guān)的臨床和實驗室檢查參數(shù)之間的關(guān)系，包括年齡、性別、French-American-British（FAB） 分型、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）數(shù)、血紅蛋白 （hemoglobin，Hb） 含量、血小板 （platelet，PLT）數(shù)、骨髓原始細(xì)胞數(shù)、染色體核型和基因突變，發(fā)現(xiàn)#1_CpG_11甲基化水平與上述預(yù)后參數(shù)之間均無相關(guān)性 （P ＞ 0.05）。依據(jù)2017年第3版AML美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò) （national comprehensive cancer network，NCCN） 指南，基于細(xì)胞遺傳學(xué)和分子學(xué)異常，AML風(fēng)險分層為低危、中危和高危3組，本研究結(jié)果表明低危組、中危組和高危組之間的SPRED1基因啟動子甲基化水平無統(tǒng)計學(xué)差異 （P ＞ 0.05），見表1。

根據(jù)在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用，突變基因分為FLT3和c-KIT （促進(jìn)增殖），CEBPA （減少分化），NPM1 （參與細(xì)胞周期調(diào)控） 以及DNMT3A、TET2和IDH1/2 （調(diào)控表觀遺傳學(xué)） 4類。50例AML患者中，46例發(fā)生了基因突變，其中，F(xiàn)LT3-ITD突變15例，c-KIT突變8例，CEBPA突變8例，NPM1突變9例，DNMT3A突變9例，TET2突變24例，IDH1/2突變17例。本研究顯示，#1_CpG_11甲基化水平與上述預(yù)后相關(guān)突變基因之間均無相關(guān)性 （P ＞ 0.05）。

3 討論

表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，主要包括染色體重塑、組蛋白修飾、DNA甲基化、非編碼RNA調(diào)控等。DNA甲基化在真核細(xì)胞中是重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，已被廣泛研究［22］。Sequenom MassARRAY 平臺具有高度的準(zhǔn)確性、敏感性和高通量，是近幾年新興的基因甲基化定量檢測方法。MassARRAY系統(tǒng)相比亞硫酸鹽測序PCR （bisulfite sequencing PCR，BSP） 能更真實地反映低甲基化區(qū)域的甲基化水平，最低可以檢測到5%［23］，因此也更能準(zhǔn)確地反映與基因表達(dá)水平之間的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平增高，且與SPRED1 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，表明SPRED1基因啟動子甲基化狀態(tài)的改變可能影響其表達(dá)并促進(jìn)白血病的發(fā)生與發(fā)展。本研究證實了抑癌基因SPRED1啟動子甲基化水平在AML患者中明顯增高，同時SPRED1基因表觀沉默。真核生物啟動子區(qū)域包括2部分，一是核心啟動子區(qū)，具備結(jié)合、控制轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物的裝配、定位轉(zhuǎn)錄起始點、控制轉(zhuǎn)錄方向和響應(yīng)胞內(nèi)激活子或抑制子等功能，二是上游序列區(qū)，決定基因轉(zhuǎn)錄的特異性、活性和效率，確保精準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄。啟動子區(qū)元件構(gòu)成及其功能對于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控至關(guān)重要，因此筆者推測這可能是SPRED1基因不同位點甲基化水平與基因表達(dá)的相關(guān)性存在差異的原因，有待進(jìn)一步研究。有研究［24］發(fā)現(xiàn)，SPRED1基因的表達(dá)水平與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)。體內(nèi)外研究［25-26］也發(fā)現(xiàn)，SPRED1基因高表達(dá)可通過抑制制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinases，ERK） 的激活有效抑制腫瘤細(xì)胞。在兒童AML中已證實SPRED1基因表達(dá)的下調(diào)與Ras/MAPK通路的激活有關(guān)［12］。因此，推測SPRED1基因啟動子高甲基化狀態(tài)引起基因表達(dá)水平降低，促進(jìn)Ras/MAPK通路激活，從而導(dǎo)致白血病的發(fā)生。

AML的發(fā)生發(fā)展與甲基化調(diào)控基因，如DNMT3A、TET2及IDH1/2的突變密切相關(guān)。DNMT3A是AML細(xì)胞DNA甲基化的重要介質(zhì)，與不良預(yù)后密切相關(guān)［9，27］。IDH1/2和TET2突變與導(dǎo)致基因組高甲基化相關(guān)［27-28］。有研究［12］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3突變與SPRED1基因低表達(dá)密切相關(guān)。CEBPA基因編碼一種造血干細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子［29］，其突變與AML患者的良好預(yù)后密切相關(guān)［19］。在本研究中，未發(fā)現(xiàn)SPRED1基因啟動子甲基化狀態(tài)與突變基因之間的關(guān)系具有統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能是由于樣本量不足所致。未來還需研究SPRED1甲基化狀態(tài)與治療反應(yīng)和預(yù)后的關(guān)系，全面了解SPRED1高甲基化狀態(tài)在AML發(fā)生發(fā)展中的作用。

表1 AML患者的臨床特征和SPRED1基因啟動子甲基化水平Tab.1 Clinical characteristics and SPRED1 gene promoter methylation in patients with AML