孫駿，張磊，趙威，馬洪冬，王新棟，李海天，楊茂偉

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001； 2. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院手足外科，遼寧 錦州 121000）

近年來糖尿病發(fā)病率日益升高，對人類的健康產(chǎn)生了嚴重的威脅。糖尿病可以導(dǎo)致多種并發(fā)癥，如心血管疾病、神經(jīng)疾病等，特別是糖尿病導(dǎo)致的糖尿病性骨質(zhì)疏松，極易出現(xiàn)致殘甚至致死的嚴重后果，帶來嚴重的經(jīng)濟及社會負擔(dān)［1］。成骨細胞、破骨細胞作為人體內(nèi)骨代謝系統(tǒng)的重要組成部分，在骨穩(wěn)態(tài)的維持中起到關(guān)鍵作用。已有大量的研究［2-3］證實高糖對于成骨細胞具有抑制作用，然而關(guān)于高糖對破骨細胞的作用目前仍然存在爭議。有研究［5］表明，高糖降低破骨細胞的分化和功能，但還有研究［6］觀察到相反的結(jié)果。2種細胞在體內(nèi)并不是單獨存在的，已有研究［7］證實二者間存在多種交流途徑，可以相互調(diào)控。還有研究［8］證實，成骨細胞可以分泌多種細胞因子，促進破骨細胞的形成。其中單核細胞趨化蛋白-1 （monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1） 對破骨細胞的分化、形成至關(guān)重要，MCP-1可以加速破骨細胞前體細胞的募集，并促進破骨細胞的分化、成熟，從而發(fā)揮骨吸收功能［9］。破骨細胞的分化成熟是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，c-fos/NFATC1通路在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，c-fos、NFATC1任一缺失將導(dǎo)致破骨細胞前體細胞無法分化為成熟的破骨細胞［10］。本研究旨在證實高糖環(huán)境下共培養(yǎng)體系中成骨細胞對破骨細胞分化的影響，并探究MCP-1/c-fos/NFATC1信號通路在破骨細胞分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及相關(guān)試劑

小鼠成骨樣細胞株MC3T3-E1及小鼠單核細胞株Raw264.7購自中國科學(xué)院細胞庫，分別用含10%胎牛血清的α-MEM、DMEM HG培養(yǎng)基 （美國 Hyclone公司）培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)加入1%青鏈霉素 （美國Invitrogen公司），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。核因子-κB受體活化因子配體 （receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、巨噬細胞集落刺激因子、小鼠MCP-1 ELISA試劑盒購自美國R＆D公司；Bindarit （MCP-1抑制劑） 購自美國MCE公司；抗MCP-1抗體購自美國CST公司；抗c-fos抗體、抗NFATC1抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 共培養(yǎng)體系的構(gòu)建以及高糖環(huán)境的加載：應(yīng)用膜孔徑為0.4 μm的6孔Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)（美國Corning公司） 構(gòu)建共培養(yǎng)體系。簡而言之，MC3T3-E1細胞密度15 000/cm2，接種于Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)下層。Raw264.7細胞密度3 000/cm2，接種于上層小室。此系統(tǒng)應(yīng)用α-MEM培養(yǎng)基 （培養(yǎng)基基礎(chǔ)糖濃度5.5 mmol/L），補充以10%胎牛血清，1%青鏈霉素，并加入50 ng/mL RANKL和30 ng/mL巨噬細胞集落刺激因子。為了探究高糖環(huán)境對共培養(yǎng)體系的影響，分別設(shè)置正常組 （糖濃度5.5 mmol/L）、高糖組（糖濃度20.5 mmol/L） 以及高糖 （糖濃度20.5 mmol/L） +Bindarit （10 ng/mL） 組，共培養(yǎng)4 d后檢測相關(guān)指標。

1.2.2 成骨細胞MCP-1分泌測定：培養(yǎng)后，提取各組培養(yǎng)基上清液，離心去除殘留細胞。應(yīng)用小鼠MCP-1試劑盒檢測上清液中MCP-1含量。具體步驟按照制造商方案進行。

1.2.3 TRAP染色測定：培養(yǎng)后，破骨細胞用4%多聚甲醛固定20 min，并根據(jù)試劑盒 （美國Sigma-Aldrich公司） 說明進行染色。含有3個或更多個細胞核的暗紅細胞計為TRAP+多核細胞。

1.2.4 Western blotting檢測：處理后，4 ℃下在細胞中加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制的裂解緩沖液裂解30 min，隨后在4 ℃下以12 000 g離心30 min后收集含有總蛋白質(zhì)的上清液。總蛋白提取后，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，通過12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品 （50 μg蛋白質(zhì)），并在60 V下轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上2 h。用含有5%脫脂乳的封閉緩沖液封閉膜2 h。然后在4 ℃以1∶100至1∶1 000稀釋的一抗孵育過夜。隨后，將膜與二抗 （抗小鼠或抗兔） 一起溫育。IgG以1∶6 000或1∶10 000稀釋并與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，在室溫下孵育2 h。用EC3成像系統(tǒng) （美國UVP公司） 顯現(xiàn)條帶，使用ImageJ軟件測量每個條帶的光密度與內(nèi)參蛋白β-actin的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 高糖環(huán)境促進成骨細胞MCP-1的表達與分泌

為了探究高糖環(huán)境對成骨細胞-破骨細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中成骨細胞MCP-1表達與分泌的影響，檢測成骨細胞MCP-1的表達。結(jié)果 （圖1A） 顯示，與正常組相比，高糖組中成骨細胞的MCP-1表達明顯升高。隨后檢測了MCP-1在本系統(tǒng)培養(yǎng)基上清中的含量。結(jié)果 （圖1B） 顯示，與正常組相比，高糖組培養(yǎng)基上清MCP-1的含量同樣明顯增加。這些結(jié)果表明，高糖環(huán)境促進了成骨細胞-破骨細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中成骨細胞MCP-1的表達與分泌。

2.2 MCP-1激活c-fos/NFATC1信號通路促進破骨細胞的分化形成

為了探討MCP-1/c-fos/NFATC1信號通路對破骨細胞分化的影響，首先檢測破骨細胞分化形成指標TRAP染色。結(jié)果 （圖2A） 顯示，與正常組相比，高糖組中TRAP+細胞數(shù)量明顯增多，而高糖+Bindarit組TRAP+細胞數(shù)量顯著減少。接下分別檢測各組破骨細胞c-fos、NFATC1蛋白的表達。結(jié)果 （圖2B） 顯示，與正常組相比，高糖組中的破骨細胞c-fos、NFATC1的表達明顯升高，而高糖+Bindarit組中破骨細胞c-fos、NFATC1的表達明顯降低。這些結(jié)果表明，高糖環(huán)境下成骨細胞可以通過MCP-1/c-fos/NFATC1信號通路調(diào)節(jié)破骨細胞的分化形成。

圖1 高糖促進成骨細胞MCP-1的表達與分泌Fig.1 High glucose increases the expression and secretion of MCP-1 in osteoblasts

3 討論

糖尿病性骨質(zhì)疏松嚴重影響人類的健康，病理性的葡萄糖水平可以打破骨形成與骨吸收之間的平衡，造成骨質(zhì)疏松的發(fā)生。本課題組前期研究［3-4］發(fā)現(xiàn)，糖尿病動物模型中存在嚴重的骨質(zhì)疏松，并且體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)高糖對成骨細胞表現(xiàn)為抑制作用。

目前的研究多數(shù)局限于高糖對于單獨的成骨細胞或破骨細胞的作用，然而在體內(nèi)，成骨細胞與破骨細胞并非單獨存在，關(guān)于高糖情況下二者之間是否存在相互作用仍然知之甚少。此外，現(xiàn)有研究對于高糖對破骨細胞的作用仍存在大量爭議。已有研究［8］證實，作為高度發(fā)達的終末細胞，旁分泌途徑是成骨細胞與破骨細胞之間交流的重要途徑之一。因此，應(yīng)用成骨細胞-破骨細胞共培養(yǎng)體系作為模型能夠更好的反映生物體內(nèi)的環(huán)境，更有利于探究其中的復(fù)雜機制。

圖2 MCP-1/c-fos/NFATC1信號通路參與調(diào)控破骨細胞的分化Fig.2 MCP-1/c-fos/NFATC1 pathway is involved in osteoclastogenesis

Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)是目前比較成熟且應(yīng)用廣泛的一個系統(tǒng)，是探究2種細胞間相互作用的極佳方式。在本系統(tǒng)中，2種細胞在共同的環(huán)境中生長而不相互接觸，而細胞分泌的細胞因子在上清液中可以自由交換。本研究采用了透光度良好的、孔徑為0.4 μm的PET膜6孔Transwell系統(tǒng)，既往研究［17］證實了該系統(tǒng)中成骨細胞具備相應(yīng)的活性，并能使破骨細胞前體細胞分化為成熟的破骨細胞并具備骨吸收功能。

MCP-1是一種趨化因子，能大量募集單核細胞并促進單核細胞的融合。有研究［11］顯示，關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動的患者呈現(xiàn)MCP-1陽性，因此MCP-1可能與破骨細胞的形成密切相關(guān)。為了進一步明確高糖環(huán)境下成骨細胞對破骨細胞分化的影響，本研究首先分析了高糖環(huán)境下共培養(yǎng)體系中成骨細胞分泌MCP-1的變化。結(jié)果顯示，高糖顯著促進成骨細胞的MCP-1分泌。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下單獨培養(yǎng)成骨細胞時，上清中MCP-1含量很低，甚至無法測出。這似乎是由于共培養(yǎng)系統(tǒng)中破骨細胞對成骨細胞的分泌同樣有重要的調(diào)控作用 （數(shù)據(jù)未顯示）。這也表明了共培養(yǎng)系統(tǒng)能夠較好的反映體內(nèi)真實環(huán)境。Bindarit能夠抑制MCP-1，可以有效的降低培養(yǎng)基中MCP-1的含量［12］。而在本系統(tǒng)內(nèi)加入Bindarit后，破骨細胞的分化水平顯著下降。這些結(jié)果提示，成骨細胞可以通過MCP-1的分泌來調(diào)控破骨細胞的分化形成。

c-fos/NFATC1信號通路的激活對破骨細胞分化至關(guān)重要。研究顯示，破骨細胞形成是由MAPK（p38、JNK和ERK） 和NF-κB途徑嚴格調(diào)節(jié)的多步驟過程，在此過程中誘導(dǎo)c-fos和NFATC1的表達，在破骨細胞分化的過程中這些途徑的消除會嚴重降低破骨細胞的形成和骨吸收功能。還有研究［13-15］表明，c-fos敲除小鼠出現(xiàn)完全缺乏破骨細胞的表型。鑒于此信號通路對破骨細胞分化的關(guān)鍵作用，本研究探究了MCP-1對此信號通路的影響，結(jié)果證明了MCP-1能顯著促進共培養(yǎng)體系中破骨細胞的分化，而應(yīng)用Bindarit后c-fos、NFATC1的表達也隨之降低，TRAP+細胞數(shù)量下調(diào)。

總而言之，本研究結(jié)果表明，高糖促進成骨細胞-破骨細胞共培養(yǎng)體系中成骨細胞的MCP-1分泌，進而激活MCP-1/c-fos/NFATC1信號通路，促進破骨細胞的分化。這些結(jié)論為治療糖尿病性骨質(zhì)疏松提供了一些思路。然而，這個共培養(yǎng)模型仍存在一定的不足，其并不能完美還原生物體內(nèi)骨細胞-成骨細胞-破骨細胞的接觸環(huán)境。目前新出現(xiàn)了一種3D培養(yǎng)模型［16］，通過植入羥基磷灰石模擬骨基質(zhì)，能更精確的反映骨細胞、成骨細胞、破骨細胞三者在生物體內(nèi)的真實接觸情況，這將成為后續(xù)研究的方向。