潘春玲，呂雪雯，王宏巖，寇育榮，潘亞萍

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所牙周病研究室，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省口腔疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，沈陽(yáng) 110002）

牙周病是牙周支持組織的慢性炎癥性疾病。在我國(guó)牙周病患病率呈高發(fā)趨勢(shì)，是患病率最高的口腔疾病。牙齦卟啉單胞菌 （Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis） 是牙周紅色復(fù)合體的組成成員，與牙周支持組織破壞關(guān)系密切［1］。牙周膜干細(xì)胞是一類具有多項(xiàng)分化能力的細(xì)胞，在牙周組織中發(fā)揮維持組織更新和修復(fù)損傷的重要作用，已被證實(shí)是牙周組織再生的重要種子細(xì)胞［2］。目前臨床上任何治療方法獲得的牙周組織再生，尤其是骨組織的修復(fù)再生，都非常有限。堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP） 是一種非特異性水解酶，是成骨細(xì)胞標(biāo)志性因子，ALP水平的升高與局部鈣化活性增高以及活躍的骨改建密切相關(guān)［3］。Runx相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子2 （Runx2） 在調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，Runx2的表達(dá)升高能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)并啟動(dòng)礦化［4］。骨鈣素 （osteocalcin，OCN） 是成骨細(xì)胞合成和分泌的一種非膠原骨基質(zhì)蛋白，OCN具有與鈣離子的高親和力和連接羥基磷灰石的能力，被認(rèn)為是骨轉(zhuǎn)換的有效標(biāo)志物，在調(diào)控骨基質(zhì)礦化方面起促進(jìn)作用［5］。本研究通過(guò)觀察P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞對(duì)其骨向分化能力的影響，檢測(cè)ALP、Runx2和OCN的表達(dá)，為應(yīng)用牙周膜干細(xì)胞修復(fù)炎性微環(huán)境中破壞的牙周組織提供理論指導(dǎo)和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌培養(yǎng)

P. gingivalis ATCC 33277 （中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔生物教研室提供） 于含5%羊血、1%氯化血紅素和0.1%維生素K1的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基固體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)菌，PBS洗滌后，重懸于無(wú)抗生素細(xì)胞培養(yǎng)基中。紫外分光光度計(jì)測(cè)量600 nm吸光度值，調(diào)節(jié)細(xì)菌菌液濃度為1×109/mL后備用。

1.2 組織塊法培養(yǎng)原代牙周膜細(xì)胞、有限稀釋法克隆純化牙周膜干細(xì)胞

選取因正畸治療需要拔除的前磨牙和第三磨牙30顆，均經(jīng)患者本人及監(jiān)護(hù)人同意，并簽署知情同意書(shū)?；颊邿o(wú)全身系統(tǒng)性疾病、家族遺傳病和特殊服藥史，臨床檢查牙齒無(wú)牙體及根尖周病變。牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［6］。收集臨床上拔除的牙齒，立即置于含PBS的離心管中，大量PBS沖洗后，無(wú)菌刀片刮取牙根中部的牙周膜組織，眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，接種于含15%血清DMEM培養(yǎng)基的6孔板中培養(yǎng)，每周換液2次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%～80%匯合時(shí)，消化并調(diào)整密度為10/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。過(guò)夜培養(yǎng)，挑選單細(xì)胞孔標(biāo)記，待細(xì)胞形成克隆后，消化并將多個(gè)單克隆來(lái)源的細(xì)胞懸液混合擴(kuò)大培養(yǎng)。選取第3～7代的牙周膜干細(xì)胞用于本研究。

1.3 牙周膜干細(xì)胞免疫組化染色和生長(zhǎng)曲線測(cè)定

牙周膜干細(xì)胞生長(zhǎng)匯合約為80%時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×104/mL，加入100 μL細(xì)胞懸液至96孔板中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每組5孔，隔日換液，連續(xù)培養(yǎng)10 d。每天取1板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，測(cè)定450 nm處的吸光度值。

制備牙周膜干細(xì)胞爬片，PBS 沖洗3遍，3% H2O2孵育10 min，PBS 沖洗，滴加鼠抗人波形蛋白單克隆抗體和鼠抗人角蛋白單克隆抗體，37 ℃ 孵育 2 h，按照DAB試劑盒說(shuō)明書(shū)染色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇逐級(jí)脫水后二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的染色情況。

1.4 茜素紅染色觀察P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞成骨分化的能力

牙周膜干細(xì)胞融合度達(dá)到80%后，按照感染復(fù)數(shù)20∶1，P. gingivalis ATCC 33277與牙周膜干細(xì)胞共同培養(yǎng)2 h，換液洗去細(xì)胞外未黏附細(xì)菌，換成含300 μg/mL慶大霉素和200 μg/mL甲硝唑的新鮮成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基 （賽業(yè)生物科技有限公司）。每隔3 d重復(fù)上述步驟，成骨誘導(dǎo)2周后，用茜素紅進(jìn)行染色。設(shè)立未成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為空白對(duì)照組，設(shè)立成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基培養(yǎng)而未加細(xì)菌感染的細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.5 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞對(duì)ALP活性的影響

按照ALP試劑盒 （碧云天生物技術(shù)公司） 操作步驟，采用對(duì)硝基苯磷酸作為酶底物來(lái)檢測(cè)ALP活性。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第7和14天時(shí)棄除培養(yǎng)液，裂解牙周膜干細(xì)胞，以12 000 r/min、4 ℃離心15 min收集的細(xì)胞裂解產(chǎn)物，96孔板中每孔加入50 μL底物緩沖液和50 μL裂解液，37 ℃孵育10 min后，加入100 μL反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)量405 nm處吸光度。根據(jù)繪制的ALP標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相應(yīng)的ALP濃度。

1.6 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞對(duì)成骨分化基因的影響

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第 7和14天時(shí)棄除培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，Trizol裂解細(xì)胞，提取樣品總 RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司） 將總 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。OCN 引物：上游5'-GCAATAAGGTAGTGAACAGACT CC-3'，下游5'-CCATAGATGCGTTTGTAGGCGG-3'。Runx2 引物：上游5'-CCTGAACTCTGCACCAAGTCC-3'，下 游5'-TCATCTGGCTCAGATAGGAGGG -3'。β-actin引物：上游5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游5'-TCGCTCCTGGAAGATGG-3'。采用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒 （日本TaKaRa公司） 實(shí)時(shí) PCR擴(kuò)增 （美國(guó)ABI公司），測(cè)定OCN和Runx2基因的相對(duì)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)、純化和鑒定

牙周膜細(xì)胞大約5 d左右從組織塊邊緣游出，20 d左右細(xì)胞融合度達(dá)80%，細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀、旋渦狀單層生長(zhǎng)，中心部較密，外部稀疏，細(xì)胞較大，長(zhǎng)梭形突起相互連接，有限稀釋克隆傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好 （圖1A）。使用CCK-8試劑盒檢測(cè)牙周膜干細(xì)胞的增殖活力，繪制的牙周膜干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈反“S”形，1～3 d細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，4～8 d細(xì)胞快速生長(zhǎng)，9 d達(dá)到平臺(tái)期 （圖1B）。免疫組化染色后鏡下可見(jiàn)波形蛋白染色陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色，細(xì)胞核染成藍(lán)色；角蛋白染色陰性，細(xì)胞核染成藍(lán)色，具有中胚層來(lái)源的成纖維細(xì)胞的特征，且無(wú)上皮細(xì)胞污染 （圖1C、1D）。

圖1 牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)、純化和鑒定Fig.1 Culture，purification，and identification of periodontal ligament stem cells

2.2 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞抑制成骨分化的能力

茜素紅染色觀察到未經(jīng)成骨礦化誘導(dǎo)的牙周膜干細(xì)胞沒(méi)有紅色礦化結(jié)節(jié)的形成，經(jīng)成骨礦化誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照組和內(nèi)化組牙周膜干細(xì)胞均可形成礦化結(jié)節(jié)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組體外形成的礦化結(jié)節(jié)大而多，而內(nèi)化組形成的礦化結(jié)節(jié)少而稀疏（圖2），表明牙周膜干細(xì)胞經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)后可以形成礦化結(jié)節(jié)，P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化后可以抑制牙周膜干細(xì)胞成骨分化的能力。

2.3 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞降低ALP活性

圖2 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞抑制成骨分化的能力 ×20 Fig.2 P. gingivalis invasion-mediated inhibition of osteogenic differentiation ability in periodontal ligament stem cells ×20

未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的牙周膜干細(xì)胞，ALP活性在第7和14天無(wú)明顯的變化。陽(yáng)性對(duì)照組和內(nèi)化組牙周膜干細(xì)胞隨時(shí)間的延長(zhǎng)，ALP活性升高。與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和內(nèi)化組牙周膜干細(xì)胞ALP活性升高，且內(nèi)化組牙周膜干細(xì)胞ALP活性低于陽(yáng)性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） （圖3）。表明牙周膜干細(xì)胞經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)后，ALP活性升高，P.gingivalis ATCC 33277內(nèi)化后可以抑制牙周膜干細(xì)胞ALP活性。

圖3 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后對(duì)ALP活性的影響Fig.3 ALP activity after osteogenic induction in periodontal ligament stem cells invaded by P. gingivalis

2.4 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞對(duì)Runx2和OCN基因表達(dá)的影響

空白對(duì)照組牙周膜干細(xì)胞Runx2基因表達(dá)在第7和14天無(wú)明顯變化。與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和內(nèi)化組牙周膜干細(xì)胞Runx2基因表達(dá)升高，且內(nèi)化組牙周膜干細(xì)胞Runx2基因表達(dá)低于陽(yáng)性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組和內(nèi)化組牙周膜干細(xì)胞隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)Runx2基因表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） （圖4A）。

空白對(duì)照組牙周膜干細(xì)胞OCN基因表達(dá)在第7和14天無(wú)明顯變化，而陽(yáng)性對(duì)照組和內(nèi)化組牙周膜干細(xì)胞OCN基因表達(dá)升高，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）。成骨誘導(dǎo)第7天陽(yáng)性對(duì)照組和內(nèi)化組OCN基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P ＞ 0.05）；在成骨誘導(dǎo)第14天，內(nèi)化組OCN基因表達(dá)明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） （圖4B）。表明牙周膜干細(xì)胞經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)后，Runx2和OCN基因表達(dá)升高，P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化后可以抑制牙周膜干細(xì)胞Runx2和OCN基因表達(dá)。

3 討論

圖4 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞對(duì)Runx2和OCN基因表達(dá)的影響Fig.4 Runx2 and OCN expression after osteogenic induction in periodontal ligament stem cells invaded by P. gingivalis

牙周病是細(xì)菌感染性疾病，其臨床表現(xiàn)為牙周支持組織不可逆性破壞，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)和脫落，是成人失牙的最主要原因。牙周治療目標(biāo)是促使被炎癥破壞的牙周支持組織再生和重建。2004年，SEO等［7］利用單細(xì)胞克隆技術(shù)，成功分離、鑒定牙周膜干細(xì)胞，其具有克隆能力、高增殖能力及形成牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的特性，實(shí)現(xiàn)組織學(xué)上真正的牙周組織修復(fù)和再生，成為牙周組織工程研究的種子細(xì)胞。因此，在牙周炎癥發(fā)生過(guò)程中，探索P. gingivalis內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞對(duì)成骨分化的影響，采取相應(yīng)的對(duì)策，將對(duì)牙周炎的損傷修復(fù)具有重要意義。

克隆形成和多向分化能力是干細(xì)胞的主要特征。本研究通過(guò)組織塊培養(yǎng)法成功培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞，經(jīng)過(guò)有限稀釋在體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，細(xì)胞呈集落樣增長(zhǎng)，在形態(tài)學(xué)上與其他間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形、旋渦狀單層生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。牙周膜干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線具有慢周期性的生物學(xué)特性，免疫組化染色后鏡下可見(jiàn)波形蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白染色陰性，具有中胚層來(lái)源的成纖維細(xì)胞的特征。通過(guò)茜素紅染色觀察到牙周膜干細(xì)胞體外經(jīng)成骨誘導(dǎo)后能夠分化為成骨細(xì)胞，形成礦化結(jié)節(jié)，證實(shí)其干細(xì)胞的特征，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

近年來(lái)許多學(xué)者對(duì)P. gingivalis毒力因子對(duì)牙周膜干細(xì)胞的影響進(jìn)行了深入研究，然而關(guān)于P. gingivalis活菌對(duì)牙周膜干細(xì)胞的影響鮮有研究，活菌感染更能真實(shí)的反映臨床疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究［8］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)P. gingivalis低感染復(fù)數(shù)長(zhǎng)期感染人永生化口腔上皮細(xì)胞后能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且具有腫瘤樣特征。本研究中在20∶1低感染復(fù)數(shù)下，牙周膜干細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯變化。此外，研究證實(shí)P.gingivalis脂多糖能夠通過(guò)Notch1信號(hào)通路，抑制成骨細(xì)胞的骨向分化潛能［9］。當(dāng)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞時(shí)，Runx2、OCN、ALP均為干細(xì)胞成骨相關(guān)因子，分別在干細(xì)胞不同成骨時(shí)期高表達(dá)［10］。Runx2是成骨細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控成骨基因的表達(dá)并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和骨形成。OCN由成骨細(xì)胞合成和分泌，主要在礦化形成期出現(xiàn)，被認(rèn)為是成骨細(xì)胞向礦化期分化的標(biāo)志之一。在骨化和成骨過(guò)程中ALP與骨的鈣化相互協(xié)調(diào)，鈣與ALP產(chǎn)生的磷酸結(jié)合成磷酸鈣沉積于骨中。本研究表明，P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化組牙周膜干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)少而稀疏，ALP活性明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化組牙周膜干細(xì)胞Runx2和OCN基因表達(dá)低于陽(yáng)性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）。結(jié)果表明，P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞后可抑制其成骨分化的能力。

近年來(lái)干細(xì)胞所處的微環(huán)境越來(lái)越受到研究者的關(guān)注，如何改善或恢復(fù)由感染而引起的牙周膜干細(xì)胞成骨能力下降成為牙周再生的一個(gè)新思路。長(zhǎng)期慢性感染微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞增殖和分化的影響尚需深入的研究，探索P. gingivalis內(nèi)化牙周膜干細(xì)胞影響骨向分化的機(jī)制，采取相應(yīng)的措施，對(duì)防治牙周炎癥具有重要意義。