李露露，蒲實(shí)，范秋靈，汪旭，李卅立

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽 110001）

糖尿病腎病 （diabetic nephropathy，DN） 是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是全世界范圍內(nèi)終末期腎衰竭的主要病因［1］。2015年，我國(guó)糖尿病相關(guān)慢性腎臟病患者已超過腎小球腎炎相關(guān)慢性腎臟病患者，成為我國(guó)住院慢性腎臟病患者的主要原因［2］。目前DN的治療方法為藥物及替代療法，但都不能做到有效治療［3］。因此，尋找用于早期診斷和有效治療的新型生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

miRNA是一類非編碼內(nèi)源性RNA （20～30個(gè)核苷酸），它通過與特定mRNA的3'非翻譯區(qū) （3'UTR）結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá)，誘導(dǎo)其降解或翻譯抑制。已有研究［4］發(fā)現(xiàn)miRNA涉及許多基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在凋亡、DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。在DN中，越來越多的研究［5］發(fā)現(xiàn)miRNA靶向炎癥、纖維化和氧化應(yīng)激等相關(guān)基因，其表達(dá)變化不僅可以用于診斷DN，還可以預(yù)測(cè)與疾病相關(guān)的分子信號(hào)機(jī)制。本研究利用miRNA芯片檢測(cè)DN患者、糖尿病患者、健康對(duì)照者血清中miRNA的表達(dá)譜，通過實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證結(jié)果，并對(duì)其功能及可能作用的靶點(diǎn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步研究DN發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及開發(fā)新的診斷和治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料及分組

選取2012年2月至2013年3月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科行腎活檢，血肝酐＜200 μmol/L，病理確診為結(jié)節(jié)性糖尿病腎小球硬化癥患者為DN組 （n = 5）； 同期本院住院治療的2型糖尿病患者 （尿微量白蛋白＜30 mg/g） 為DM組 （n = 5）；2組患者均符合WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn) （空腹血糖≥7 mmol/L或口服75 g無水葡萄糖粉2 h后血糖≥11.1 mmol/L）。同期于本院健康體檢者為對(duì)照組 （n = 5），對(duì)照組空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白、血肝酐均在正常范圍內(nèi)，尿微量白蛋白＜30 mg/g。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤、心血管疾病、肝損傷等可能影響miRNA表達(dá)的慢性疾病。DN組、DM組和對(duì)照組年齡、性別、吸煙史、血壓、血管危險(xiǎn)因素相匹配。

1.2 標(biāo)本收集

采用非抗凝管收集空腹外周血 （5 mL），室溫下放置0.5～2 h凝固，使用CS-15R離心機(jī) （德國(guó)BECKMAN公司）， 4 ℃， 1 700 g離心10 min，分組收集血清后再以2 000 g離心10 min完全去除細(xì)胞碎片。等分后-80 ℃儲(chǔ)存。

1.3 血清總RNA提取和純化

按照TRIzol LS Reagent （美國(guó)Invitrogen公司） 和mirvanaTMmiRNA isolation kit （美國(guó)Ambion公司） 使用說明書進(jìn)行RNA提取和純化，nanodrop-2000檢測(cè)純化RNA濃度，凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.4 miRNA芯片高通量篩選

將提取血清總RNA進(jìn)行靶標(biāo)制備，芯片雜交，芯片清洗染色與掃描后，應(yīng)用miRNA芯片分析系統(tǒng)（Affymetrix? GeneChip? Command ConsoleTM1.1，miRNA QC Tool軟件） 篩選3組血清中表達(dá)有差異的miRNAs。篩選標(biāo)準(zhǔn)：（1） B通道，Ratio≥2為上調(diào)＞2倍的miRNA；（2） A通 道，Ratio≤0.5為 下 調(diào)＞2倍 的miRNA。參 照miRNA數(shù)據(jù)庫the Sanger miRBase miRNA database V11確認(rèn)miRNA的序列，并應(yīng)用Cluster 3.0 軟件進(jìn)行聚類分析。

1.5 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。

1.6 生物學(xué)信息分析

應(yīng)用互聯(lián)網(wǎng)miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件Pictar、Targetscan、MiRanda在線服務(wù)站點(diǎn)搜索差異表達(dá)miRNA的預(yù)測(cè)靶基因，取至少2個(gè)軟件預(yù)測(cè)到的基因作為主要靶基因。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 芯片實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 DM組與對(duì)照組miRNA表達(dá)比較：結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DM組患者血清中20個(gè)miRNA （miR-572、miR-603、miR-375等） 表達(dá)上調(diào)，其中miR-572上調(diào)最明顯 （4.22倍），見圖1；22個(gè)miRNA （miR-15b、miR-138、miR-875-5p等） 表達(dá)下調(diào)，其中miR-15b下調(diào)最明顯 （34.97倍），見圖2。

圖1 與對(duì)照組比較DM組血清中上調(diào)的miRNAs

圖2 與對(duì)照組比較DM組血清中下調(diào)的miRNAs

2.1.2 DN組與DM組miRNA表達(dá)比較：結(jié)果顯示，與DM組比較，DN患者血清中42個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，包括miR-193a-5p、 miR-517c、 miR-155、 miR-638等，其中miR-193a-5p與miR-517c上調(diào)最明顯 （分別為8.07倍、7.95倍），見圖3；19個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，包括miR-127-3p、miR-375、miR-572等，其中miR-127-3p下調(diào)最明顯 （28.49倍），見圖4。相反，DM組與對(duì)照組比較差異最顯著的是miR-572和miR-15b （miR-572反而下調(diào)4.61倍，miR-15b上調(diào)1.88倍）。而DM組與對(duì)照組比較，血清中miR-193a-5p下調(diào)2.09倍，miR-517c在對(duì)照組中未檢測(cè)出，miR-127-3p上調(diào)3.97倍。

圖3 與DM組比較DN組血清中上調(diào)的miRNAs

2.2 RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

為了驗(yàn)證miRNA芯片數(shù)據(jù)的可靠性，選擇部分差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)照組、DM組和DN組中miR-1179呈遞增式上調(diào)，miR-148b、miR-150呈遞減式下調(diào)，見表1。

2.3 miR-1179、miR-148b和miR-150靶基因預(yù)測(cè)

miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件結(jié)果顯示，miR-148b調(diào)控763個(gè)預(yù)測(cè)靶基因 （BCL2、USP33、ZFYVE26、TGFB2、HSPA4L、PODXL、FGF2等） 的表達(dá)，廣泛參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、足細(xì)胞損傷、wnt-β通路調(diào)控的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化等病理過程，見表2。miR-150調(diào)控287個(gè)預(yù)測(cè)靶基因 （ Notch信號(hào)通路、MAPK13、CBL、GLUT4等，參與細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等的表達(dá)）。miR-1179調(diào)控337個(gè)預(yù)測(cè)靶基因 （TGFBR2、ZNF22、 MTPN、 FGF11、 CDH6、 SMAD等） 的表達(dá)，廣泛參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)增生等病理過程。

圖4 與DM組比較DN組血清中下調(diào)的miRNAs

表1 3組miR-1179上調(diào)倍數(shù)和miR-148b、miR-150下調(diào)倍數(shù)比較Tab.1 Comparison of the fold downregulation of miR-148b and miR-150，and the fold upregulation of miR-1179 among the three groups

表2 miR-148b的預(yù)測(cè)靶基因Tab.2 Predicted target genes of miR-148b

3 討論

目前，對(duì)于DN診斷和疾病進(jìn)展檢測(cè)依賴于尿微量白蛋白檢測(cè)。然而并非所有微量白蛋白尿患者都會(huì)出現(xiàn)明顯的蛋白尿和腎病。此外，檢測(cè)到微量蛋白尿時(shí)組織損傷和炎癥可能已經(jīng)發(fā)生，微量蛋白尿?qū)N無特異性，僅是腎小球損傷的一個(gè)標(biāo)志。腎活檢目前是診斷DN的主要方式，但是這種侵入性且昂貴的手術(shù)仍有3%發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)［6］。因此，發(fā)現(xiàn)診斷和判斷DN預(yù)后的新型生物標(biāo)志物具有重要意義。

miRNA是一類能夠調(diào)控mRNA表達(dá)的小分子非編碼RNA。據(jù)報(bào)道，在人類已鑒定出2 500余種成熟miRNA，調(diào)節(jié)至少60%的蛋白質(zhì)編碼基因［7］。因此，miRNA可以調(diào)節(jié)許多基因表達(dá)，以改變關(guān)鍵的細(xì)胞功能來影響各種疾病的進(jìn)展。由于miRNA在生物流體 （尿液和血漿） 中穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)隨著高通量測(cè)序、定量PCR、微陣列技術(shù)的建立，作為DN敏感、非侵入性和階段特異性精確診斷的生物標(biāo)志物，miRNA研究已經(jīng)變得非常有意義［5］。許多miRNA與DN的發(fā)生或微量白蛋白尿的出現(xiàn)相關(guān)，并直接靶向腎臟纖維化途徑，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和抑癌基因PTEN，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病腎臟病理損傷［8］。另一方面，由于疾病進(jìn)展的癥狀和分子機(jī)制可能因患者而異，未來患者可能會(huì)根據(jù)其個(gè)體miRNA特征分離出個(gè)性化藥物和治療。課題組先前研究［9］發(fā)現(xiàn)，miR-503和miR-181d在糖尿病KKAy小鼠腎小球內(nèi)的表達(dá)顯著上調(diào)，氯沙坦治療可抑制其在糖尿病狀態(tài)下的異常表達(dá)，可能為DN提供新的有效治療方法。

本研究發(fā)現(xiàn)3組血清中存在249個(gè)差異性表達(dá)的miRNA；其中miR-1179呈遞增式上調(diào)，miR-148b、miR-150呈遞減式下調(diào)。miR-1179調(diào)控337個(gè)預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)，包括TGFBR2、ZNF22、MTPN、FGF11、CDH6、SMAD等，廣泛參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)增生等病理過程的發(fā)生。近期研究［10-12］發(fā)現(xiàn)miR-1179靶向細(xì)胞周期蛋白 （cyclin E1，CCNE1） 與非小細(xì)胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC） 的細(xì)胞增殖相關(guān)，miR-1179靶向E2F轉(zhuǎn)錄因子5 （E2F5） 控制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，miR-1179過表達(dá)可通過E2F5抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，此外，在胰腺癌細(xì)胞miR-1179的過表達(dá)抑制細(xì)胞遷移和侵襲，而其在DN中的作用尚未見報(bào)道。

miR-148b調(diào)控763個(gè)預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)，包括TGFB2、BCL2、USP33、ZFYVE26、TGFB2等，廣 泛 參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、足細(xì)胞損傷、wnt-β通路調(diào)控的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化等病理過程的發(fā)生。研究［13］發(fā)現(xiàn)miR-148靶向TGF-β通路調(diào)節(jié)皮膚傷口愈合過程中的血管生成和內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此猜測(cè)miR-148的下調(diào)可能促進(jìn)TGF-β信號(hào)增強(qiáng)，與DN纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。目前已有不少研究［14］報(bào)道m(xù)iR-148b在不同疾病中的作用機(jī)制 （miR-148/miR-152家族成員是自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病和多種癌癥的預(yù)后標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)）。SERINO等［15］在腎臟疾病中發(fā)現(xiàn)血清miR-148b和let-7b對(duì)于診斷IgA腎病具有特異性，可能是一個(gè)新型、可靠、非侵入性的診斷方法；此外，KUWAGATA等［16］發(fā)現(xiàn)在糖尿病狀態(tài)下，缺氧近端腎小管上皮細(xì)胞 （proximal tubular cell，PTC） 中mTORC1活化，其通過減少miR-148b-3p表達(dá)使TNFR2過表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)致病途徑可能成為糖尿病PTC損傷的新療法。miR-148可能在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其可能的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

miR-150調(diào)控287個(gè)預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)，包括Notch信號(hào)通路、MAPK13、CBL、GLUT4等，參與細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等。近年來，許多臨床研究發(fā)現(xiàn)miR-150具有潛在的預(yù)后價(jià)值。在慢性淋巴性白血病中，miR-150顯著下調(diào)，與疾病的發(fā)生相關(guān)［17］。在各種其他實(shí)體腫瘤組織 （肺癌、乳腺癌、食道癌、結(jié)腸直腸癌和胰腺癌） 中也發(fā)現(xiàn)了miR-150的異常表達(dá)。miR-150已被證實(shí)在食管鱗狀細(xì)胞癌和原發(fā)性結(jié)直腸癌中顯著下調(diào)，預(yù)示著預(yù)后不良。在乳腺癌細(xì)胞系中，miR-150表達(dá)增加，促進(jìn)生長(zhǎng)和克隆形成，并減少細(xì)胞凋亡。另外的研究表明miR-150在其他腫瘤 （前列腺癌和甲狀腺癌） 中表達(dá)增加。miR-150有可能成為監(jiān)測(cè)癌癥預(yù)后和進(jìn)展的新的預(yù)測(cè)因子［18］。在狼瘡性腎炎中，miR-150通過下調(diào)SOCS1促進(jìn)腎臟纖維化，是狼瘡性腎炎腎損傷的生物標(biāo)志物［19］。YANG等［20］發(fā)現(xiàn)miR-150可能在DN間充質(zhì)干細(xì)胞的治療中發(fā)揮重要作用。此外，XIE等［21］通過比較有和沒有大量白蛋白尿的2型糖尿病患者尿外泌體中差異性表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-150-5p上調(diào)，可能是早期DN患者的新型生物標(biāo)志物。

綜上所述，本研究結(jié)果豐富了DN miRNA差異表達(dá)譜，這些差異性表達(dá)的miRNA可能涉及DN的發(fā)生和發(fā)展，但需進(jìn)一步對(duì)篩選出的差異miRNA進(jìn)行多中心、大樣本的臨床驗(yàn)證和功能學(xué)研究，進(jìn)而將研究成果向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，找到DN的新型生物標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。