魯兵 張振宇 倪荔 嚴(yán)東羿 朱哲 高瑋 袁彪 楊颻 傅傳剛

直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是直腸癌患者面臨的主要問題。但在局部微環(huán)境條件合適時(shí)，游離出來的癌癥細(xì)胞能夠與腹膜間質(zhì)細(xì)胞相粘附促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。在影響癌細(xì)胞粘附的眾多因素之中，白介素1β（IL-1β）與腫瘤的發(fā)展關(guān)系密切。既往研究顯示IL-1β參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等多種過程。本研究以體外原代培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度IL-1β 和IL-1β抗體對(duì)腹膜間皮細(xì)胞與直腸癌細(xì)胞黏附的影響；從而明確IL-1β在直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移中的作用。

材料與方法

一、材料

人直腸癌細(xì)胞株HT-29購自上海中科院細(xì)胞庫。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.人腹膜間皮細(xì)胞原代培養(yǎng)：

（1）無菌條件下，將臨床手術(shù)（臨床樣本來自于在同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院胃腸外科接受擇期手術(shù)治療、無腹腔炎癥、種植轉(zhuǎn)移的直腸癌患者，術(shù)前均簽署知情同意）獲得的人網(wǎng)膜樣本剪碎，用預(yù)冷并含有雙抗的PBS清洗3遍。（2）用0.1%Ⅰ型膠原酶在37 ℃恒溫條件下震蕩消化2 h。（3）1000 rpm 離心10 min，吸去上層脂肪組織及油脂，PBS重懸沉淀。（4）200目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，并再次1000 rpm離心5 min，棄上清。（5）沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液裂解5 min。（6）PBS沖洗兩遍，1000 rpm離心5 min棄上清。（7）沉淀中加入含10%FBS和1%雙抗的1640培養(yǎng)基重懸，以5×105/孔的密度接種至6孔板中，6孔板提前用多聚賴氨酸包被，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。（8）每3天進(jìn)行換液，細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合時(shí)1:3進(jìn)行傳代，取第2、3代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.人腹膜間皮細(xì)胞免疫熒光染色鑒定：

細(xì)胞爬片的制作。

（1）24孔板中放入Fisher brand蓋玻片，加入250 uL的多聚賴氨酸，37 ℃ 10 min；（2）棄多聚賴氨酸，超凈臺(tái)UV消毒2～3 h。（使用前用ddH2O或PBS洗兩遍）；（3）細(xì)胞用胰酶消化后離心（懸浮細(xì)胞可不用胰酶消化），用完全培養(yǎng)基重懸，并細(xì)胞計(jì)數(shù)；（4）取適量細(xì)胞懸液分別滴到圓片上，30 min后，在24孔板中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基至500 uL，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h以上；（5）取出24孔板，用PBS漂洗2遍；（6）4%多聚甲醛處理（室溫）10 min；（7）PBS漂洗，5 min，3遍；（8）0.5%Triton X-100 處理（室溫）5 min；（9）PBS漂洗，5 min，3遍；（10）封閉（室溫）1 h；（11）孵育一抗4 ℃孵育過夜；（12）PBS漂洗，5 min，3遍；（13）孵育熒光二抗，RT孵育 1～2 h；（14）PBS漂洗，5 min，3遍；（15）DAPI，5 min；（16）PBS漂洗，5 min，3遍；（17）封片劑封片（可用帶抗淬滅劑的封片劑封片，片子保存時(shí)間更久），鏡下觀察在熒光顯微鏡下拍照。

3.直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)：

細(xì)胞培養(yǎng)與凍存：使用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，在常規(guī)條件下培養(yǎng)HT-29細(xì)胞（37 ℃、5%CO2），每3～4天胰酶消化后傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞胰酶消化后，使用10%DMSO 以1×107/mL細(xì)胞濃度分裝，液氮凍存。

4. IL-1β/anti-IL-1β與人腹膜間皮細(xì)胞共孵育：

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置為2組：（1）單藥組：使用0、1、5、10、15 ng/mL濃度IL-1β與對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)腹膜間皮細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共孵育6h；（2）雙藥組：在經(jīng)0、1、5、10 ng/mL IL-1β 處理過的間皮細(xì)胞中，分別加入終濃度為0、0.1、0.5、1.0 μg/ mL 的 anti-IL-1β 以拮抗 IL-1β 的作用。其中以0 ng/mL IL-1β/0 μg/mL anti-IL-1β處理組為對(duì)照組。

5. DiI 標(biāo)記HT-29細(xì)胞：

取HT-29細(xì)胞與10 μg/mL DiI染液在37 ℃、5%CO2條件下共孵育20 min，并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記情況。

6. FACS檢測(cè)細(xì)胞黏附率：

接種間皮細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合成單層，細(xì)胞數(shù)約為4×104/孔時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。首先使用IL-1β/anti-IL-1β按上述方法預(yù)處理間皮細(xì)胞。然后將DiI標(biāo)記好的過量HT-29細(xì)胞接種接種于24孔板，與間皮細(xì)胞在37 ℃、5%CO2條件下共孵育。4 h后D-Hanks液沖洗3次，并使用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，800 r/min離心5 min，細(xì)胞沉淀使用1 mL PBS重懸浮，各取6個(gè)復(fù)孔用于實(shí)驗(yàn)。以565 nm為發(fā)射波長(zhǎng)，549 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，檢測(cè)10 000個(gè)樣本。細(xì)胞黏附率（R）計(jì)算公式為：R=R2/（R1＋R2），其中R1通道代表未標(biāo)記的間皮細(xì)胞，R2通道代表DiI標(biāo)記的HT-29細(xì)胞。

三、統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0完成。各組黏附率以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間細(xì)胞黏附率的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析；本研究以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、人腹膜間皮細(xì)胞原代培養(yǎng)和鑒定

原代培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞在4天左右可半量換液，大約2周左右可以傳代，具體細(xì)胞狀態(tài)見圖1。免疫熒光染色證明原代培養(yǎng)細(xì)胞中的Vimentin表達(dá)陽性；人腹膜間皮細(xì)胞標(biāo)志物為Vimentin，經(jīng)IF鑒定波形蛋白（Vimentin）陽性率為85%，人von Willebrand（VWF）因子表達(dá)陰性；說明分離出來的細(xì)胞均為腹膜間皮細(xì)胞（圖2）。

二、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞黏附率

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果可知（圖3、圖4），隨著IL-1β濃度的增加，細(xì)胞粘附率依次增加，當(dāng)加入抗體IL-1β后，隨著抗體濃度的增加，人腹膜間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞與癌細(xì)胞粘附率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。且5 ng/mL的IL-1β含量時(shí)，細(xì)胞粘附率最高，顯著高于其他組（P＜0.05）；10ng/mL的IL-1β含量時(shí)粘附率高于其他組，僅低于5 ng/mL的IL-1β組；加入抗體IL-1β后所有組別的粘附率趨勢(shì)與不加前一致，但是所有組別的粘附率均降低，1 ng/mL IL-1β組＋0.1 μg/mL抗體組和5 ng/mL IL-1β組＋0.5 μg/mL抗體組的細(xì)胞粘附率最高，陰性對(duì)照組細(xì)胞粘附率最低，顯著低于其他組（P＜0.05）。

圖1 人腹膜間皮細(xì)胞原代培養(yǎng)照片。1A：第1天，1B：第3天，1C：第5天，1D：第9天，1E：P1代，1F：P2代（×100倍）

討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移涉及多基因、多機(jī)制和多步驟調(diào)控，轉(zhuǎn)移性細(xì)胞與宿主相互作用并發(fā)生不同形式的轉(zhuǎn)歸，如凋亡、休眠和侵襲增殖，從而影響轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展。腹腔殘余癌細(xì)胞與間皮細(xì)胞等局部微環(huán)境相互作用是腹膜轉(zhuǎn)移的起始步驟之一，然而轉(zhuǎn)移細(xì)胞形成臨床轉(zhuǎn)移效率極低［1-2］，這與細(xì)胞粘附、侵襲能力、機(jī)體免疫監(jiān)視及腫瘤細(xì)胞休眠等多種因素調(diào)密切相關(guān)［3-4］。

不恰當(dāng)?shù)氖中g(shù)操作被認(rèn)為能增加直腸癌細(xì)胞腹膜播散風(fēng)險(xiǎn)，脫落入腹腔的癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞之間的黏附則是決定腹腔轉(zhuǎn)移灶形成的首要環(huán)節(jié)。在這一過程中體液免疫和多種細(xì)胞因子，對(duì)于游離癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸起到重要作用。白介素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子，在細(xì)胞信息傳遞、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)［5-7］及腫瘤生長(zhǎng)和侵襲中起到廣泛作用［8-10］。本研究將腹膜間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞和癌細(xì)胞共培養(yǎng)并用不同的濃度IL-1β進(jìn)行處理，結(jié)果提示隨著IL-1β濃度增高，細(xì)胞的粘附率顯著增加；當(dāng)同時(shí)加入不同含量anti-IL-1β抗體，細(xì)胞粘附率再次被明顯抑制。提示IL-1β能夠促進(jìn)直腸癌HT-29與腹膜間皮細(xì)胞粘附，從而促進(jìn)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移。

圖2 原代培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞鑒定結(jié)果。2A：DAPI染色，2B：Vimentin染色，2C：Merge，2D：DAPI染色，2E：VWF染色，2F：Merge （×100倍）

既往研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌患者外周血中IL-1β水平顯著高于健康人群［9-10］，腹部手術(shù)后IL-1β表達(dá)水平普遍升高，可用于評(píng)價(jià)手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)患者免疫功能的影響［11］。Cheong 等［12］研究發(fā)現(xiàn) IL-1β 可參與手術(shù)創(chuàng)傷后腹膜細(xì)胞外基質(zhì)的重建，是發(fā)生腹腔內(nèi)粘連的原因之一。本研究結(jié)果顯示腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)IL-1β處理后，隨著IL-1β濃度增加，其與癌細(xì)胞的黏附率逐漸升高，并且這種作用可被其抑制劑抗IL-1β所阻斷。近期的研究顯示，IL-1β能夠通過作用于表達(dá)IL-1Ra的人腹膜間皮細(xì)胞上調(diào)其ICAM-1分子表達(dá)水平，從而促進(jìn)癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞的粘附［13-15］。本研究也顯示IL-1β增強(qiáng)癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞黏附的效應(yīng)能夠被anti-IL-1β所特異性阻斷。

目前結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)，其發(fā)病率已位居全球惡性腫瘤的第3位、中國第4位［16-17］。在結(jié)直腸癌根治術(shù)后，即便是早期結(jié)直腸癌，仍有超過30～40%患者死于術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［18-20］。以微創(chuàng)為顯著特征的腹腔鏡結(jié)直腸手術(shù)開創(chuàng)結(jié)直腸癌治療新領(lǐng)域，推動(dòng)了外科治療的快速發(fā)展。既往大量研究證明［21-25］，腹腔鏡手術(shù)相較于傳統(tǒng)開腹手術(shù)，術(shù)中出血量少、術(shù)后恢復(fù)快、并發(fā)癥少，臨床效果優(yōu)于傳統(tǒng)手術(shù)組［26］，對(duì)患者免疫功能的影響更?。?7］。免疫功能的變化可能對(duì)患者腹腔微轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生影響，對(duì)于腹腔鏡手術(shù)是否造成結(jié)直腸癌尤其是局部晚期結(jié)直腸癌腹膜播散轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加，以及能否行腹腔鏡根治術(shù)目前爭(zhēng)議較大。其原因很多，除腹腔鏡手術(shù)中CO2氣腹對(duì)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的微環(huán)境的影響外，目前熱點(diǎn)還多集中于腹腔鏡手術(shù)對(duì)于患者免疫機(jī)能的影響，以及對(duì)于微轉(zhuǎn)移灶轉(zhuǎn)歸的影響［28］。研究已經(jīng)證實(shí)腹腔鏡手術(shù)相較于傳統(tǒng)手術(shù)，術(shù)后IL-1β升高水平更低，對(duì)患者免疫功能影響更?。?9］，本研究證實(shí)隨著IL-1β濃度增高，直腸癌細(xì)胞與間皮細(xì)胞粘附率顯著增加；當(dāng)加入不同含量anti-IL-1β抗體，細(xì)胞粘附率被明顯抑制。以上結(jié)果均提示IL-1β能夠促進(jìn)直腸癌HT-29與腹膜間皮細(xì)胞粘附，從而促進(jìn)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移；腹腔鏡手術(shù)因其微創(chuàng)，引起的IL-1β水平升高顯著低于開腹手術(shù)，故可以減少由IL-1β介導(dǎo)的直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果。3A：陰性對(duì)照組，3B：0 ng/mL IL-1β組，3C：1 ng/mL IL-1β組，3D：5 ng/mL IL-1β組，3E：10 ng/mL IL-1β組，3F：0 ng/mL IL-1β＋ 0 μg/mL抗體組，3G：1 ng/mL IL-1β＋0.1 μg/mL抗體組，3H：5 ng/mL IL-1β ＋ 0.5 μg/mL 抗體組，3I：5 ng/mL IL-1β ＋ 1 μg/mL 抗體組

圖4 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的粘附率結(jié)果