張味娜，張明明，俞 敏

(寧海縣第一醫(yī)院 藥劑科，浙江 寧海 315600)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的特征為持續(xù)性氣流受限，可導(dǎo)致氣道和肺臟慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)。作為一類慢性疾病，COPD對(duì)病人、家庭及社會(huì)經(jīng)濟(jì)壓力持久且繁重，成為全球范圍內(nèi)關(guān)注的健康問(wèn)題[1]。COPD的發(fā)病機(jī)制主要包括蛋白酶/抗蛋白酶失衡學(xué)說(shuō)、炎癥學(xué)說(shuō)、氧化抗氧化失衡學(xué)說(shuō)等。COPD 的主要病變特征是淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞(PMN)和巨噬細(xì)胞(AM)等浸潤(rùn)的小氣道炎癥反應(yīng)。COPD等慢性呼吸疾病的治療原則包括隔離含有污染顆粒的空氣，解除支氣管內(nèi)皮細(xì)胞周圍持續(xù)的炎癥以及氧化應(yīng)激環(huán)境[2-5]。廣藿香酮是廣藿香(Pogostemoncablin(Blanco)Benth)的重要化學(xué)成分之一，具有良好的抗菌抗炎作用[6-7]。廣藿香酮對(duì)胃潰瘍大鼠有一定的保護(hù)作用[8]，抑制炎癥調(diào)節(jié)因子防止小鼠內(nèi)毒素性休克[9]；直接阻斷T細(xì)胞增殖，改變炎性細(xì)胞因子分布從而治療自身免疫性疾病[10]。另外，廣藿香酮通過(guò)其抗氧化和抗炎特性表現(xiàn)出顯著的光保護(hù)活性[11]。本研究通過(guò)構(gòu)建COPD小鼠模型觀察廣藿香酮對(duì)肺損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性ICR小鼠60只，體重18～22 g，由蘇州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，飼養(yǎng)室溫25±1 ℃，相對(duì)濕度55±10 %，燈光12 h交替。

1.2 試劑和儀器 廣藿香酮(純度99%)由第二軍醫(yī)大學(xué)提供，地塞米松購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司，白介素-6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司，核因子E-2-相關(guān)因子2(Nrf-2)、血紅素氧合酶1(HO-1)、磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκBα)、核因子κB抑制蛋白(IκBα)、磷酸化核因子κBp65(p-NF-κBp65)、核因子κBp65(NF-κBp65)、GAPDH抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，RT-6500 酶標(biāo)儀購(gòu)自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 60只ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地塞米松組(1 mg/kg)、低劑量廣藿香酮組(40 mg/kg)、高劑量廣藿香酮組(80 mg/kg)五組，各12只。模型組及對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，其他各組按照給藥劑量進(jìn)行灌胃。

1.4 COPD小鼠模型制備 采用反復(fù)香煙煙熏法復(fù)制小鼠COPD模型[12-13]，將小鼠放入自制的染毒箱(60 cm×30 cm×20 cm) 內(nèi)，將香煙點(diǎn)燃后放入煙熏箱中。小鼠每天吸煙2次，上午下午各1次，每次30 min，1次10支煙，連續(xù)8周。從第5周起，在煙熏開(kāi)始前1 h灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥4周后處死小鼠。

1.5 血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量檢測(cè) 小鼠眼眶取血，1917 g 離心15 min 后取上清液于-80℃凍存?zhèn)溆谩０凑?ELISA 試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.6 肺中SOD、MDA含量檢測(cè) 凍存的肺組織按照重量(g) ∶體積(mL) =1∶9的比例加入生理鹽水勻漿后，4℃ 1917 g離心10 min后取上清液凍存于-80℃?zhèn)溆?。依?jù)BCA說(shuō)明書操作方法檢測(cè)蛋白濃度，并按照SOD、MDA 試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)其含量。

1.7 肺病理學(xué)檢查 小鼠肺組織在4%甲醛中固定24 h后常規(guī)石蠟包埋，切片及HE染色用于觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.8 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 將部分凍存的肺組織與預(yù)冷的蛋白裂解液及PMSF勻漿后，12 000 g，4℃離心15 min取上清。肺組織總蛋白濃度經(jīng)BCA 法測(cè)定后，經(jīng)10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后TBST洗3次；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后將PVDF膜分別與Nrf-2、HO-1、p-IκBα、IκBα、p-NF-κBp65、NF-κBp65、GAPDH一抗(1∶1000)孵育，4℃過(guò)夜。在TBST洗膜3次，每次10 min后，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶1000) 室溫反應(yīng)2 h。TBST 洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光液顯影，天能曝光儀曝光，quantity one測(cè)定主帶的光密度值用于計(jì)算相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)肺損傷的影響 與模型組比較，地塞米松組和廣藿香酮高、低劑量組小鼠肺組織中單核巨噬細(xì)胞為主的肺泡壁減少、肺內(nèi)支氣管炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺內(nèi)支氣管上皮中度變性壞死減少，杯狀細(xì)胞化生減少，管腔內(nèi)細(xì)胞或粘液阻塞減輕，管壁色素沉著減少，見(jiàn)圖1。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：地塞米松組(1 mg/kg)；D：低劑量廣藿香酮組(40 mg/kg)；E：高劑量廣藿香酮(80 mg/kg)。圖1 廣藿香酮對(duì) COPD 小鼠肺損傷的影響(HE，×200)

2.2 對(duì)血清TNF-α、IL-6、IL-1β 含量的影響 與對(duì)照組比較，COPD 模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、 IL-1β 含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，地塞米松組和廣藿香酮高、低劑量組血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 的含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)表1。

表1 廣藿香酮對(duì) COPD 小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量的影響

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。

2.3 對(duì)肺中SOD、MDA含量的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織中SOD含量減少，MDA含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，地塞米松組和廣藿香酮高、低劑量組肺組織中SOD含量均增加，MDA含量均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)表2。

2.4 對(duì)肺中相關(guān)蛋白的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺p-IκBα、p-NF-κBp65蛋白表達(dá)增加，Nrf-2、HO-1蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高劑量廣藿香酮組能減少炎癥相關(guān)蛋白p-IκBα、p-NF-κBp65的表達(dá)，增加抗氧化相關(guān)蛋白Nrf-2、HO-1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)圖2，表3。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：地塞米松組(1 mg/kg)；D：低劑量廣藿香酮組(40 mg/kg)；E：高劑量廣藿香酮(80 mg/kg)圖2 廣藿香酮對(duì)COPD小鼠肺中相關(guān)蛋白的影響

表2 廣藿香酮對(duì) COPD 小鼠肺中SOD、MDA含量的影響

表3 廣藿香酮對(duì)COPD小鼠肺中相關(guān)蛋白的影響

3 討論

COPD 發(fā)病與吸煙和空氣中污染物顆粒如 PM2.5、PM10、氮氧化物及硫氧化物等有密切聯(lián)系，其機(jī)制主要是這些顆粒促使支氣管內(nèi)皮細(xì)胞處于持續(xù)性氧化和炎癥環(huán)境中，即氣道、肺實(shí)質(zhì)及肺血管的慢性氧化應(yīng)激和炎癥。本研究通過(guò)香煙煙熏誘導(dǎo)構(gòu)建COPD小鼠模型，建模結(jié)果與COPD 病理特征一致[13]。

研究表明[14]，炎癥因子在COPD的氣道炎癥反應(yīng)中起著重要作用，如IL-1、IL-6、IL-8、 IL-18、TNF-α、TGF-β和LTB4等。本研究結(jié)果顯示，廣藿香酮能減少COPD小鼠中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量，提示其具有一定的抗炎作用。作為核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB廣泛存在于真核細(xì)胞中，促進(jìn)基因的翻譯與表達(dá)。研究表明[15]，NF-κB信號(hào)通路在COPD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，NF-κB與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和凋亡關(guān)系密切，激活NF-κB信號(hào)通路能增加TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，廣藿香酮能減少COPD小鼠肺中p-IκBα、p-NF-κBp65蛋白表達(dá)，提示廣藿香酮可能是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制炎癥因子的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)[16]，COPD患者中慢性氧化應(yīng)激能夠誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激；活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)增加能減少粘膜功能，減少內(nèi)皮細(xì)胞粘附和細(xì)胞外基質(zhì)重建，ROS的增加能夠激活NF-κB炎癥通路。而Nrf-2/HO-1信號(hào)通路在抗氧化中起著重要作用[16]。本研究結(jié)果顯示，廣藿香酮能增加COPD小鼠肺中SOD含量，減少M(fèi)DA含量，增加Nrf-2、HO-1蛋白的表達(dá)，提示廣藿香酮具有一定的抗氧化作用。

綜上所述，廣藿香酮對(duì)COPD小鼠肺損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)。