陳小潔　苑召虎　陽雪新　楊惠寬　羅淑蘭

[摘要] 目的 研究CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）在血小板輸注無效癥（PTR）患者中的表達和意義。 方法 選取2017年4月～2018年4月廣州市第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的重癥再生障礙性貧血（SAA）發(fā)生PTR患者34例作為為研究組。另取選取同期我院收治的SAA未發(fā)生PTR患者44例作為對照組。分別檢測并比較兩組患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及血漿TGF-β1表達水平，并采用受試者工作特征曲線（ROC）分析上述兩項指標在PTR中的診斷效能。 結果 輸注前后研究組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達水平低于對照組（P < 0.05），且研究組血漿TGF-β1水平低于對照組（P < 0.05）。經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、TGF-β1聯(lián)合檢測診斷PTR的曲線下面積、敏感性、特異性高于上述兩項指標單獨檢測（P < 0.05）。 結論 PTR患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及TGF-β1水平均存在明顯低表達，臨床工作中可通過聯(lián)合檢測上述兩項指標的表達情況，為臨床PTR的防治提供參考依據(jù)。

[關鍵詞] 血小板輸注無效癥;CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞;轉(zhuǎn)化生長因子-β1;表達意義

[中圖分類號] R457.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）06（a）-0080-04

Expression and significance of CD4+CD25+ regulatory T cells and transforming growth factor-β1 in patients with platelet transfusion refractoriness

CHEN Xiaojie? ?YUAN Zhaohu? ?YANG Xuexin? ?YANG Huikuan? ?LUO Shulan

Department of Blood Transfusion， Guangzhou First People′s Hospital， Guangzhou Province， Guangdong? ?5100180， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of CD4+CD25+ regulatory T cells and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in patients with platelet transfusion refractoriness （PTR）. Methods Thirty-four patients with severe aplastic anemia （SAA） who had PTR from April 2017 to April 2018 in Guangzhou First People′s Hospital （"our hospital" for short） were selected as the study group. Another 44 SAA patients without PTR were selected as the control group. The expression levels of CD4+CD25+ regulatory T cells and plasma TGF-β1 were detected and compared in the two groups， and the diagnostic performance of the two indicators in PTR was analyzed by receiver operating curve （ROC）. Results The expression levels of CD4+CD25+ regulatory T cells in the study group before and after infusion were lower than those in the control group （P < 0.05）， and the plasma TGF-β1 level in the study group was lower than that in the control group （P < 0.05）. According to ROC curve analysis， the area， sensitivity and specificity of CDT+CD25+ regulatory T cells and TGF-β1 combined detection and diagnosis of PTR were higher than those of the above two indicators （P < 0.05）. Conclusion CD4+CD25+ regulatory T cells and TGF-β1 levels in PTR patients are significantly lower than those in control group. The expression of these two indicators can be detected in clinical work， which can provide reference for the prevention and treatment of PTR.

[Key words] Platelet transfusion refractory; CD4+CD25+ regulatory T cells; Transforming growth factor-β1; Significance of expression

血小板輸注可有效治療或預防由于血小板減少或血小板功能障礙所導致的出血，該治療方式最早于1910年被應用于臨床中，目前已得到飛速發(fā)展，是血液系統(tǒng)疾病的重要支持治療手段[1]。然而，隨著近年來相關研究的不斷深入，越來越多的學者發(fā)現(xiàn)多次反復地使用血小板輸注治療可能會增加血小板輸注無效癥（PTR）發(fā)生的風險，不僅會延誤患者病情，加重患者家庭以及社會的經(jīng)濟負擔，同時會導致血小板資源的浪費[2]。迄今為止，導致血小板輸注無效的具體機制尚未完全明確，但有學者[3]認為可能涉及遺傳、免疫以及環(huán)境等多種因素，其中調(diào)節(jié)性T細胞在維持外周免疫耐受中起著至關重要的作用，其表達變化以及免疫抑制功能下降均可能導致了機體免疫調(diào)節(jié)機制的紊亂，進一步促進了PTR的發(fā)生。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是近年來所發(fā)現(xiàn)的一類新型的具有調(diào)節(jié)細胞生長與分化功能的TGF-β超家族成員之一，其可在免疫調(diào)節(jié)、細胞分化以及細胞凋亡等方面發(fā)揮極其重要的作用[4]。本研究通過探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及TGF-β1在PTR患者中的表達和意義，旨在為臨床診治提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月～2018年4月廣州市第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的重癥再生障礙性貧血（SAA）發(fā)生PRT患者34例作為研究組。納入標準：①經(jīng)血象、活檢以及骨髓穿刺等檢查確診為重癥再生障礙性貧血（SAA）;②連續(xù)接受ABO同型血小板輸注2次無效，血小板計數(shù)未見明顯提高，臨床出血癥狀未見改善;③年齡≥18歲;④無臨床病歷資料缺失者;⑤輸注24 h后血小板校正增加值降低者。排除標準：①合并其他血液系統(tǒng)疾病者;②伴有嚴重感染性疾病或免疫系統(tǒng)疾病者;③無法正常交流溝通或存在精神疾病者;④伴有惡性腫瘤疾病者;⑤正參與其他研究者。其中男20例，女14例;年齡18～67歲，平均（49.47±5.42）歲;病程2～55個月，平均（5.34±2.21）個月。另取同期我院收治的SAA非PTR患者44例作為對照組。納入標準：①所有患者均經(jīng)血象、活檢以及骨髓穿刺等檢查確診為SAA;②年齡≥16歲;③無臨床病歷資料缺失者;④無發(fā)生連續(xù)血小板輸注無效。排除標準：與研究組相同。其中男25例，女19例;年齡23～68歲，平均（50.12±5.37）歲;病程1～58個月，平均（5.27±2.19）個月。輸注效果判斷標準：輸注24 h后以患者出血狀況得到明顯改善作為輸注有效，并采用血小板校正增加值（CCI）作為量化判斷依據(jù)，輸注24 h后CCI>7.0×109/L均為有效，否則為無效;所有輸注時患者均排除發(fā)熱、感染、脾腫大等影響血小板數(shù)量的因素。所有血小板制品均來源于廣州血液中心的機采血小板，每袋機采血小板容量約250 mL，含血小板數(shù) ≥2.5×1011/L。兩組上述各項指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。所有患者均已同意本研究，并簽署了知情同意書，且本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 血小板輸注? 所有SAA患者均依照2000年版《臨床輸血技術規(guī)范》[5]輸注血小板，根據(jù)患者血小板計數(shù)（×109/L）和臨床出血癥狀決定是否申請輸注血小板：>50×109/L，一般不需輸注;>（10～50）×109/L，根據(jù)臨床出血情況決定是否輸注;<（5～10）×109/L，立即輸血小板防止出血。血小板輸注治療：所有患者均輸注ABO血型相匹配的單采血小板，每袋約為250～300 mL，每次輸注1 U血小板，輸注前靜脈予以地塞米松5 mg（福州海王福藥制藥有限公司，生產(chǎn)批號：20161022，規(guī)格：1 mg/片），預防輸血反應。同時根據(jù)血小板計數(shù)以及病情選擇合理的輸注時機，避免發(fā)熱時輸注。

1.2.2 標本收集? 對照組輸注前標本來自患者血小板輸注前的配血標本，輸注后標本選自血小板輸注24 h后抗凝標本;研究組輸注前標本來自發(fā)生PRT當次輸注前配血標本，研究組輸注后標本選自當次輸注療效評估抗凝標本。流式細胞儀檢測CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達水平;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿TGF-β1水平。相關操作均按照儀器（試劑盒）說明書進行。

1.2.3 試劑與儀器? CytoFLEX型流式細胞儀購自美國Beckman-Coulter公司;TGF-β1試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司（生產(chǎn)批號：180609）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達情況比較

兩組輸注前后CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;但研究組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達水平低于對照組（P < 0.05）。見表1。

2.2 兩組血漿TGF-β1水平比較

兩組輸注前后血漿TGF-β1水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;但研究組血漿TGF-β1水平低于對照組（P < 0.05）。見表2。

2.3 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、TGF-β1表達水平診斷PTR的ROC曲線分析

經(jīng)ROC曲線分析可知，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、TGF-β1聯(lián)合檢測診斷PTR的曲線下面積、敏感性、特異性高于上述兩項指標單獨檢測（均P < 0.05）。見表3、圖1。

3 討論

PTR主要是指患者在連續(xù)接受2次血小板輸注治療，血小板計數(shù)仍無提高[6-8]。隨著近年來血小板輸注的開展日益廣泛，PTR已成為目前臨床亟待解決的難題之一。相關研究[9-10]表明，PTR的發(fā)生率為30%～70%，血小板表面含有復雜抗原、人類淋巴細胞抗原抗體等均是引發(fā)PTR的重要因素。其中反復多次輸血時，由于異體間抗原系統(tǒng)的差異，刺激機體產(chǎn)生同種免疫反應，對外源性血小板產(chǎn)生抗體，是導致PTR的最重要免疫性因素[11-12]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及TGF-β1均參與了機體免疫反應過程[13-14]，對上述指標與PTR的關系進行研究，可為臨床PTR的防治提供參考依據(jù)。

TGF-β是一種分布廣泛的免疫調(diào)節(jié)因子，在下調(diào)T細胞介導的免疫應答和控制自身免疫方面具有重要作用，尤其是在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)揮抑制效應中的作用引起人們的關注，但結論不一。目前有關TGF-β在誘導和維持CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞免疫抑制作用中的觀點矛盾[15-17]：①有些實驗支持TGF-β在誘導和維持CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞免疫抑制效應中發(fā)揮不可或缺的作用。②另一些研究則表明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的免疫抑制功能不依賴于TGF-β的存在。支持前者的依據(jù)是：活化的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達高水平的膜表面TGF-β，通過與相應靶細胞的TGF-β以細胞間直接接觸的方式而發(fā)揮抑制效應;本研究對這兩個指標實施監(jiān)測，結果表明輸注前后對照組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達水平高于研究組（均P < 0.05），提示PTR患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞存在明顯低表達。外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞占單個核細胞的1%～2%，占CD4+T細胞的5%～10%，在維持機體外周免疫耐受過程中起著至關重要的免疫調(diào)節(jié)作用[18-19]。而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞可能是通過影響機體外周免疫耐受，從而降低血小板輸注的效果，促進了PTR的發(fā)生。因此，可通過相關干預措施提高患者體內(nèi)的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞水平，從而達到提高血小板輸注治療效果的目的。此外，輸注前后對照組血漿TGF-β1水平高于研究組（P < 0.05），提示血漿TGF-β1在PTR患者中存在顯著低表達。TGF-β1可通過影響基質(zhì)細胞血小板生成素所誘導的信號轉(zhuǎn)導過程，尤其是降低促分裂原活化蛋白激酶、信號轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)錄活化蛋白5以及胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1、2的活性，實現(xiàn)其抑制聚合細胞增殖的作用，并通過對T細胞以及單核細胞所具有的免疫調(diào)節(jié)作用產(chǎn)生不同程度的影響，進一步發(fā)揮促進機體免疫耐受恢復以及減輕血小板破壞的作用[20-22]。而隨著TGF-β1表達的降低，機體免疫耐受受損加重，且血小板破壞程度增加，繼而增加了PTR發(fā)生的風險。經(jīng)ROC曲線分析可知，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、TGF-β1聯(lián)合檢測診斷PTR的曲線下面積、敏感性、特異性高于上述兩項指標單獨檢測。提示了在臨床工作中可聯(lián)合檢測上述兩項指標表達情況，從而有利于評估臨床血小板輸注治療效果，并為PTR的治療提供了新的靶點和思路。

綜上所述，PTR患者體內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞以及TGF-β1水平均存在明顯低表達，聯(lián)合CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞與TGF-β1表達情況，有助于PTR的診斷。

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（收稿日期：2018-12-18? 本文編輯：王? ?蕾）