耿彥梅 高晗 孫福仁 李雪利 張肖建 田方 董璐萌 曾永禎 李軍山

摘要：為了更好地評價不同產地蒼耳子標準湯劑的出膏率、綠原酸含量及含量轉移率，對蒼耳子標準湯劑的質量進行了研究。采用日本ShimadzuLC-20A型高效液相色譜儀，AgilentZorbaxEclipseC18色譜柱（2.1mm×250mm，5.0μm），以乙腈-磷酸為流動相，柱溫為28℃，流速為1mL/min，檢測波長為327nm，建立了蒼耳子標準湯劑中綠原酸含量的測定方法。結果表明：15批蒼耳子標準湯劑出膏率的均值為4.30%，均值±3SD為3.28%～5.32%;綠原酸含量均值為3.44mg/g，均值±3SD為0～7.16mg/g;綠原酸含量轉移率均值為36.54%，均值±3SD為0.66～72.42%;不同產地蒼耳子的出膏率較為穩(wěn)定，但綠原酸含量及含量轉移率差異較大。經(jīng)方法學考察，蒼耳子標準湯劑中綠原酸含量測定方法穩(wěn)定，具有較高的重復性、穩(wěn)定性及可信度，可用于蒼耳子標準湯劑的質量評價，為蒼耳子配方顆粒后續(xù)研究及大規(guī)模生產提供數(shù)據(jù)支持。

關鍵詞：醫(yī)藥工程;蒼耳子;標準湯劑;含量測定;綠原酸

中圖分類號：R917文獻標志碼：A

文章編號：1008-1534（2019）02-0122-06

蒼耳子為菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥成熟帶總苞的果實，秋季果實成熟時采收，經(jīng)干燥、去除梗和葉等雜質而得[1]。蒼耳子始載于《神農本草經(jīng)》，原名葈耳實，列為中品。《本草綱目》記載，呆耳，亦名胡耳，蒼耳等?！侗静萜穮R精要》記載蒼耳子“有毒”。蒼耳子所含化學成分復雜多樣，主要包括黃酮類、倍半萜類、噻嗪類、水溶性苷類、甾醇類、酚酸及其衍生物、蒽醌類、揮發(fā)油類等化學成分[2-11]。研究表明，蒼耳子中各成分含量無明顯差異，但其中主要成分綠原酸的含量地域差異性較大[12-13]?，F(xiàn)代研究表明，蒼耳子具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗過敏、抗菌、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等功效[14-18]。

目前，人們對蒼耳子飲片化學成分及特征圖譜的研究相對比較透徹，但針對蒼耳子標準湯劑的研究寥寥無幾。筆者通過對15批蒼耳子標準湯劑的制備及其主成分含量測定進行研究，探討蒼耳子煎液的生產工藝及質量評價，為蒼耳子配方顆粒后續(xù)研究及大生產提供數(shù)據(jù)支持。

1主要儀器與材料

1.1儀器

日本ShimadzuLC-20A型高效液相色譜儀，AgilentZorbaxEclipseC18色譜柱（2.1mm×250mm，5.0μm），分析天平（賽多利斯），JM-A5002電子天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司提供，十萬分之一），水循環(huán)真空泵（上海申生科技有限公司提供），DHG-9140A熱風循環(huán)鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司、太倉精宏儀器設備有限公司提供），KH3200E型超聲波清洗器（江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供）。

1.2材料

綠原酸對照品，批號為110749-201718，純度為99.3%，中國食品藥品檢定研究院提供;甲醇，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司提供;乙腈，天津市科密歐化學試劑有限公司提供;磷酸，HPLC級，美國ACS公司（上海）提供。

1.3飲片

15批蒼耳子飲片經(jīng)河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任鑒定為菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥成熟帶總苞的果實。樣品詳細信息見表1。

2實驗部分

2.1標準湯劑的制備

2.1.1制備方法

取蒼耳子藥材，壓扁，稱取100g，轉移至圓底燒瓶中，第1次加8倍量純化水，浸泡30min，加熱煎煮20min，將藥液趁熱過50μm（300目）濾布;第2次加6倍純化水，煎煮15min，將藥液趁熱過50μm（300目）濾布。合并2次煎液。將提取液放入冰浴中快速冷卻，將冷卻后的提取液倒入旋轉蒸發(fā)儀中，于真空低溫濃縮（溫度不超過60℃），濃縮至生藥量與藥液體積之比約為1∶3，將濃縮液冷凍干燥，即得蒼耳子標準湯劑。

2.1.2制備條件

稱取蒼耳子飲片100g若干份，分別考察破碎、不同提取溶劑對蒼耳子標準湯劑出膏率、綠原酸含量及含量轉移率3個參數(shù)的影響。結果見表2和表3。

從表2和表3可以看出，破碎、提取溶劑均對蒼耳子標準湯劑的出膏率、綠原酸含量及含量轉移率有影響。其中，蒼耳子壓扁后，有助于蒼耳子中成分的溶出，相關指標明顯高于未壓扁組。純化水為提取溶媒時，干膏得率基本接近，而蒼耳子標準湯劑中綠原酸含量、含量轉移率明顯高于飲用水組。

結合《中藥配方顆粒質量控制與標準技術要求》（征求意見稿）中關于標準湯劑制備的指導原則，蒼耳子為辛涼解表藥，屬清熱類藥物，煎煮時間不宜過長，2次煎煮以20min和15min為宜;同時，當加入8倍量水時，即可完全浸泡蒼耳子飲片，所以2次加水量分別為8倍和6倍。

2.1.315批湯劑的制備

按2.1.1項所述方法，制備15批不同產地、不同批號的蒼耳子藥材，得到15批蒼耳子標準湯劑。

2.2色譜條件

采用AgilentZorbaxEclipseC18色譜柱（2.1mm×250mm，5.0μm），流動相為乙腈-0.4%（體積分數(shù)，下同）磷酸溶液（二者體積比為10∶90），等度洗脫，流速為1mL/min，檢測波長為327nm，柱溫為28℃，進樣量為10μL。

2.2.1對照品溶液的制備

取綠原酸對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得對照品溶液（于10℃以下保存）。

2.2.2供試品溶液的制備

將蒼耳子標準湯劑膏粉研細，取0.1g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入含5%甲酸的50%甲醇25mL，稱定質量，超聲20min，放冷，再稱定質量，用含5%甲酸的50%甲醇補足減失的質量，搖勻，過0.45μm濾膜，即得。

2.2.3方法學考察

1）專屬性考察

使用空白溶劑作為陰性對照，通過對照品溶液指認蒼耳子標準湯劑樣品中的綠原酸峰，進行專屬性試驗，見圖1。在綠原酸出峰位置處，陰性樣品未見有明顯干擾，說明本方法的專屬性良好。

2）線性考察

精密稱定綠原酸對照品0.072531g，置于50mL棕色量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。分別吸取上述儲備液1，2，4，6，8，10mL于20mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。分別吸取以上各對照品溶液2μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以綠原酸質量濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，如圖2所示，回歸方程為y=3×106x-128.41，R2=0.9999，表明綠原酸質量濃度為0.073～1.451mg/mL時線性關系良好。

3）精密度考察

取蒼耳子飲片，按2.2.2項所述方法制備供試品1份，重復測定6次。結果顯示，蒼耳子標準湯劑中綠原酸平均含量為4.10mg/g，RSD值為0.95%，說明儀器符合精密度要求。

4）重復性考察

取蒼耳子飲片，按2.2.2項所述方法制備供試品，平行制備6份樣品，測得蒼耳子標準湯劑中綠原酸的平均含量為4.09mg，RSD值為0.09%，符合《中華人民共和國藥典》中的相關規(guī)定（≤1.5%）。

5）穩(wěn)定性考察

取2.2.2項下供試品，分別在0，3，6，9，12h測定綠原酸含量。結果表明，蒼耳子標準湯劑膏粉供試品在12h內綠原酸的平均含量為3.89mg/g，RSD值為0.57%，表明供試品在12h內較為穩(wěn)定。

6）準確度考察

精密稱取蒼耳子（含量為4.09mg/g）標準湯劑膏粉6份，每份0.05g。分別精密吸取綠原酸對照品溶液（質量濃度為0.03984mg/mL）5mL，按供試品溶液的制備方法，再分別精密加入含5%甲酸的50%甲醇溶液20mL，制成6份供試品溶液。加樣回收率的范圍為100.96%～102.69%，平均回收率為101.62%，RSD值為0.77%，符合《中華人民共和國藥典》中的相關要求（回收率限度為95%～102%）。

7）檢測限與定量限

檢測限：按照《中華人民共和國藥典》第四部附錄9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則進行測定，將已知低濃度供試品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，信噪比為3∶1，綠原酸最低質量濃度為1.28×10-1μg/mL。

定量限：按照《中華人民共和國藥典》第四部附錄9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則進行測定，將已知低濃度供試品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，信噪比為10∶1，能被定量測定的綠原酸的最低質量濃度為5.54×10-1μg/mL。

3結果及分析

3.115批蒼耳子標準湯劑綠原酸含量測定

取15批蒼耳子標準湯劑膏粉，分別按2.2.2項所述方法制備供試品溶液，測定結果如表4和表5所示。

3.2綠原酸含量及含量轉移率結果分析

15批蒼耳子標準湯劑出膏率均值為4.30%，均值±3SD為3.28%～5.32%;綠原酸含量均值為3.44mg/g，均值±3SD范圍為0～7.16mg/g;綠原酸含量轉移率均值為36.54%，均值±3SD為0.66～72.42%。15批標準湯劑出膏率、綠原酸含量及含量轉移率均在此范圍內。

結果表明，不同產地的蒼耳子標準湯劑的出膏率差異較小，綠原酸含量及含量轉移率差異較大，存在地域性差異?？傮w來看，內蒙古地區(qū)的蒼耳子飲片含量及標準湯劑中綠原酸的含量及含量轉移率都較黑龍江、吉林地區(qū)高。

4討論

4.1提取溶劑及提取方式考察

通過對含5%甲酸的10%甲醇、含5%甲酸的30%甲醇、含5%甲酸的50%甲醇、含5%甲酸的70%甲醇、100%甲醇進行比較可知，含5%甲酸的50%甲醇對蒼耳子標準湯劑中綠原酸的提取效率最高，故選擇含5%甲酸的50%甲醇作為提取溶劑。經(jīng)對比不同超聲時間（10，20，30，40min），發(fā)現(xiàn)超聲時間對蒼耳子標準湯劑綠原酸的提取效率影響不大，考慮超聲時間過長會導致溶液過熱，故將超聲時間定為20min。

4.2色譜條件考察

分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-水4個流動相體系。結果表明，乙腈-0.1%磷酸對綠原酸的分離效果最佳，且各峰峰形相對較好。

4.3檢測波長選擇

分別選擇310，327，340nm作為檢測波長進行試驗，發(fā)現(xiàn)不同檢測波長下綠原酸的峰面積有較大差異，以327nm下測定的綠原酸色譜峰面積最大，且分離度較好，故選擇327nm作為檢測波長。

5結語

為規(guī)范中藥配方顆粒質量與標準的相關研究，《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》（征求意見稿）指出，中藥配方顆粒需要建立的標準主要包括初始原料的中藥材標準、提取用原料飲片標準、中間體標準以及成品標準。為了更好地建立各中藥配方顆粒的相關標準，建立相關含量的測定方法顯得尤為重要。藥材及飲片中各含量的測定方法在《中華人民共和國藥典》中已有相應的規(guī)定，建立配方顆粒中間體及成品的標準是一項迫在眉睫的任務。

本次研究建立了蒼耳子標準湯劑中綠原酸含量的測定方法，此方法具有較高的穩(wěn)定性，可用于蒼耳子標準湯劑的質量研究。通過選取具有代表性產地的15批蒼耳子標準湯劑進行制備，確定了蒼耳子標準湯劑的出膏率范圍、綠原酸含量及含量轉移率范圍，為蒼耳子配方顆粒的后續(xù)研究及大生產提供了數(shù)據(jù)支持。

《中華人民共和國藥典》中規(guī)定蒼耳子羧基蒼術苷的含量不得超過0.35%。通過實驗發(fā)現(xiàn)，由于蒼耳子標準湯劑中羧基蒼術苷的含量大大降低，因而常規(guī)方法不能更準確地測定羧基蒼術苷的含量。為更好地反映蒼耳子標準湯劑的質量標準，后續(xù)工作應繼續(xù)完善蒼耳子中羧基蒼術苷含量的測定研究。

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