鄧霖芳　袁帥　劉江云

中圖分類號 R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）16-2226-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.13

摘 要 目的：建立博落回提取物中血根堿的離子交換樹脂分離純化工藝。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）測定博落回提取物中血根堿含量，色譜柱為Cosmosil C18-R-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%醋酸溶液（25 ∶ 75，V/V），流速為1 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。通過靜態(tài)吸附與解吸附試驗，對比8種離子交換樹脂對血根堿的吸附和解吸附性能;采用優(yōu)選離子交換樹脂，考察最佳上樣液濃度、上樣pH值以及上樣體積;采用APPS 10D液相制備系統(tǒng)，考察動態(tài)洗脫條件，獲得博落回精提物溶液;采用反相C18色譜柱對博落回精提物溶液脫鹽、洗脫并干燥，獲得精制純化物。采用HPLC法測定所得精制純化物的純度，并采用HPLC法、紫外分光光度法、質(zhì)譜法、核磁共振法分別對其進行結(jié)構確證。結(jié)果：篩選獲得CM-FF型樹脂用于博落回提取物中血根堿的分離純化，以含20%甲醇、0.25 mol/L氯化鈉的20 mmol/L醋酸銨溶液100 mL進行洗脫。優(yōu)化的動態(tài)吸附條件為上樣濃度6.0 mg/mL、上樣pH值5.5、上樣體積25 mL;洗脫精提物經(jīng)脫鹽和精制后，最終獲得純度為97%的精制純化產(chǎn)物（純化收率為71%），并經(jīng)結(jié)構確證其為血根堿。結(jié)論：優(yōu)選的離子交換樹脂分離純化工藝綠色環(huán)保、安全高效、易于操作，可用于博落回提取物中血根堿單體的分離純化，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

關鍵詞 博落回;血根堿;離子交換樹脂;分離;純化

Study on Separation and Purification Technology of Sanguinarine from the Extract of Macleaya cordata by Ion Exchange Resin

DENG Linfang1，YUAN Shuai2，3，LIU Jiangyun2（1. Dept. of Pharmacy， the Third Affiliated Hospital of Zhejiang? Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China; 2. School of Pharmacy， Soochow University， Jiangsu Suzhou 215123， China; 3. Dept. of Pharmacy， Wuxi Hospital of TCM， Jiangsu Wuxi 214071， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the separation and purification technology of sanguinarine from the extract of Macleaya cordata with ion exchang resin. METHODS： The content of sanguinarine from the extract of M. cordata was determined by HPLC， with? Cosmosil C18-R-Ⅱ column （250 mm×4.6 mm，5 μm）， mobile phase of acetonitrile-0.2% acetic acid solution （25 ∶ 75，V/V）， the flow rate of 1 mL/min， detection wavelength of 270 nm， column temperature of 30 ℃， and sample size of 20 μL. Static adsorption and desorption tests were carried out to compare the adsorption and desorption properties of 8 ion exchange resins for sanguinarine. The optimum concentration of sample solution， pH value and volume of sample were investigated by optimum ion exchange resin. APPS 10D liquid phase preparation system was used to investigate the dynamic elution conditions and obtain M. cordata refined extract solution. The refined purified product of M. cordata was obtained by desalination， elution on a reversed-phase （RP） C18 column and drying.? The purity of the purified product was analyzed by HPLC. The structure of the purified product was confirmed by HPLC， UV spectrophotometry， MS and NMR. RESULTS： CM-FF resin was screened for the separation and purification of sanguinarine from M. cordata extract. It was eluted with 20 mmol/L ammonium acetate solution 100 mL containing 20% methanol and 0.25 mol/L sodium chloride. The optimal dynamic absorption condition included that the concentration of sample was 6.0 mg/mL at pH 5.0，and the loading amount was 25 mL; after desalination and refinement， for the eluted refined extract， the purified product with 97% purity （purified yield? of 71%） was obtained， and its structure was confirmed to be sanguinarine. CONCLUSIONS： The optimal separation and purification technology by ion exchange resin is green， safe， efficient and easy to operate， which can be used for the separation and purification of sanguinarine from M. cordata extract and is suitable for industrial production.

KEYWORDS? ?Macleaya cordata; Sanguinarine; Ion exchange resin; Separation; Purification

博落回[Macleaya cordata （Willd） R.Br.]是罌粟科博落回屬多年生草本植物，全草入藥，在我國主要集中分布于江蘇、浙江、云南、貴州、湖南、湖北、廣西、廣東及臺灣等地區(qū)[1]。博落回富含生物堿，至今已被分離并鑒定的單體生物堿達74個，其中含量最高且生物活性較強的為苯并異喹啉類生物堿，主要包括血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿等[2-6]。其中，血根堿具有明顯的抗菌、抗腫瘤以及保肝護肝等藥理活性[7-12]。在歐美和日本等發(fā)達國家，血根堿常作為抗菌藥物的替代品被廣泛用于畜牧業(yè)及魚類養(yǎng)殖[13-14]。目前，我國對于高純度的血根堿尚無便捷、高效的規(guī)模化分離純化方法。盡管大孔吸附樹脂法用于提取純化黃酮類及內(nèi)酯酮類天然產(chǎn)物有著優(yōu)異的表現(xiàn)[15-16]，但由于血根堿及其類似物獨特的苯并雜原子共軛體系結(jié)構導致其化學性質(zhì)特殊[13]，使用大孔吸附樹脂對其進行純化時需使用大量的甲醇、乙醇等有機溶劑，造成純化成本高、難于規(guī)?；a(chǎn)。生物堿成分在中性或酸性條件下以正離子形式存在，可采用陽離子交換樹脂進行富集分離。離子交換樹脂商品化已數(shù)十年，其質(zhì)量可靠、成本較低、環(huán)境污染小，近些年越來越多的應用于黃酮類、生物堿類等天然產(chǎn)物的分離純化[17]。因本研究目標產(chǎn)物血根堿為季銨型生物堿[13]，采用離子交換樹脂柱進行純化分離具有一定優(yōu)勢。因此，本研究旨在開發(fā)一種高效的離子交換工藝，用于制備高純度的血根堿，為后續(xù)該生物堿的進一步研究開發(fā)奠定工藝基礎。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）;APPS10D型制備液相色譜儀、Φ15 mm型GCC可壓縮玻璃柱（蘇州利穗科技有限公司）;ME215S型電子天平、PB-10型pH計（德國Sartorius公司）;MP2002型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）;N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）;SHZ-82型恒溫振蕩器（金壇市富華儀器有限公司）;DZF型電熱恒溫真空干燥箱（上海邁捷實驗設備有限公司）;Simplicity UV型超純水機（德國Millipore公司）;KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

血根堿對照品[本實驗室自制，批號：20170501，純度：97.1%（按HPLC測定、歸一化法計算）];CM-FF型弱陽離子交換樹脂、SP-HP型強陽離子交換樹脂[博格隆（上海）生物技術有限公司];CGC100×4型弱陽離子交換樹脂、PCG600F型反相樹脂、PCG900F型反相樹脂[漂萊特（中國）有限公司];S40型強陽離子交換樹脂（蘇州賽分科技有限公司）;PIPO-02型大孔吸附樹脂（廣州牌牌生物科技有限公司）;SP50型強陽離子交換樹脂（蘇州知益微球科技有限公司）;C18制備級填料（75 μm，日本Cosmosil公司）;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

博落回藥材購自湖南，經(jīng)蘇州大學藥學院陸葉副教授鑒定為罌粟科植物博落回（Macleaya cordata）的果莢。

2 方法與結(jié)果

2.1 血根堿的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Cosmosil C18-R-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.2%醋酸溶液（25 ∶ 75，V/V）;流速：1 mL/min;檢測波長：270 nm;柱溫：30 ℃;進樣量：20 μL。在該色譜條件下，血根堿與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)大于5 000（圖略）。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定血根堿對照品12.86 mg，置于50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）使其完全溶解后定容，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取“2.2”項下制備的博落回提取物樣品25.48 mg，置于50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲使其完全溶解后定容，即得。

2.1.4 線性關系考察 取“2.1.2”項下對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，以甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，制得系列質(zhì)量濃度的線性對照品溶液。取上述稀釋溶液與原未經(jīng)稀釋的對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣測定。以血根堿質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為：y=101.07x-398.04（r=0.999 2，n=3）。結(jié)果表明，血根堿質(zhì)量濃度在25.72～257.2 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.4”項下質(zhì)量濃度為154.3 μg/mL的線性對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，血根堿峰面積的RSD為1.07%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，血根堿峰面積的RSD為1.53%（n=5），表明供試品溶液于室溫下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗 取已知含量的博落回提取物樣品12 mg，共6份，精密稱定，分別加入質(zhì)量濃度為1.528 mg/mL對照品溶液（按“2.1.2”項下方法制備）2 mL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按標準曲線法計算含量并計算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為98.2%（RSD=1.06%，n=6），表明方法準確度良好。

2.2 博落回提取物的制備及含量測定

按照文獻[18]方法，取博落回藥材10 kg，粉碎，用pH 2～3的稀硫酸溶液提取，過濾，濾液以100 mmol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH至10～12，靜置，過濾，真空低溫干燥，得博落回提取物120 g。按“2.1”項下方法，取該提取物樣品制備供試品溶液并測定，結(jié)果所得提取物中血根堿的含量為24.49%，色譜圖見圖1。

2.3 博落回提取物中血根堿的離子交換樹脂純化工藝考察

2.3.1 上樣溶液的制備 稱取“2.2”項下制備的博落回提取物樣品500 mg，置于250 mL量瓶中，加入甲醇50 mL，超聲使其溶解后，以20 mmol/L醋酸銨溶液定容至刻度，即得。

2.3.2 解吸附液的制備 量取甲醇50 mL，置于250 mL量瓶中，加入氯化鈉7.32 g、20 mmol/L醋酸銨溶液適量，超聲使氯化鈉溶解后，以20 mmol/L醋酸銨溶液定容至刻度，即得。

2.3.3 離子交換樹脂種類篩選 采用靜態(tài)吸附與解吸附試驗進行篩選。（1）靜態(tài)吸附試驗。稱取經(jīng)預處理的不同種類樹脂（CM-FF、SP-HP、CGC100×4、PCG600F、PCG900F、S40、PIPO-02、SP50）各2 g，分別置于50 mL錐形瓶中，均精密加入“2.3.1”項的上樣溶液20 mL，室溫下以120 r/min振蕩吸附3 h;精密吸取上層清液1 mL，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，以含有20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液定容至刻度。取該溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算樹脂吸附前后上樣液中血根堿的質(zhì)量濃度，并按公式計算樹脂的靜態(tài)飽和吸附量：靜態(tài)飽和吸附量（mg/g）=（吸附前血根堿的初始質(zhì)量濃度-吸附飽和后血根堿的質(zhì)量濃度）×吸附液體積/樹脂稱樣量。（2）解吸附試驗。將吸附飽和的各樹脂分別轉(zhuǎn)移至50 mL錐形瓶中，以水洗滌3次，加入“2.3.2”項的解吸附液20 mL，室溫下以120 r/min振蕩吸附5 h;精密吸取上層清液1 mL，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，以含有20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液定容至刻度。取該溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算解吸附液中血根堿的質(zhì)量濃度，并按公式計算解吸附量及解吸附率：解吸附量=解吸附液中血根堿質(zhì)量濃度×解吸附液體積，解吸附率（%）=解吸液中血根堿質(zhì)量濃度×解吸液體積/靜態(tài)飽和吸附量×100%，結(jié)果見表1（注：表中“-”表示未在解吸附液中測得血根堿，提示該成分在此解吸附液條件下未能從樹脂上洗脫）。

由表1可見，CM-FF、SP-HP型號的樹脂對血根堿的解吸附量及解吸附率明顯高于其他類型的樹脂;其他類型的樹脂雖然靜態(tài)飽和吸附量更高，但解吸附性能較差，尤其是PIPO-02型號的大孔樹脂，在試驗洗脫條件下無法解吸附血根堿，這一結(jié)果與以往文獻報道[19]一致。而綜合考慮靜態(tài)吸附和解吸附參數(shù)后認為，CM-FF型樹脂較SP-HP型樹脂對血根堿的吸附與洗脫性能更優(yōu)，因此本研究選取CM-FF型樹脂作進一步工藝參數(shù)考察。

2.3.4 CM-FF型樹脂的動態(tài)吸附條件考察 （1）博落回提取物上樣液質(zhì)量濃度考察。精密稱取5份等質(zhì)量的CM-FF型樹脂適量，濕法裝填，制得柱床體積（BV）為20 mL的離子交換制備柱。取5份“2.2”項下制備的博落回提取物各適量，以含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液制成質(zhì)量濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的溶液。分別取上述溶液30 mL，以5 mL/min的流速上樣，收集流出液，按“2.1”項下方法測定血根堿質(zhì)量濃度，根據(jù)公式計算CM-FF型樹脂的動態(tài)吸附量[動態(tài)吸附量（mg）=（吸附前血根堿的質(zhì)量濃度×吸附前藥液體積）-（吸附后血根堿的質(zhì)量濃度×吸附后藥液體積）]。結(jié)果，當博落回提取物的上樣液質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL時，動態(tài)吸附量達峰值36.46 mg;而隨著博落回提取物質(zhì)量濃度的進一步增加，動態(tài)吸附量反而下降（見圖2A）。因此，本研究確定博落回提取物上樣液質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL。

（2）上樣pH值考察。精密稱取8份等質(zhì)量的CM- FF型樹脂適量，按“（1）”項下方法裝填離子交換制備柱。配制含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液8份，分別用醋酸調(diào)整pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，并以上述溶液分別對柱床進行平衡。另取8份“2.2”項下制備的博落回提取物適量，以含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液制成質(zhì)量濃度均為6.0 mg/mL的溶液。分別取上述溶液30 mL，以醋酸調(diào)整至相應pH值后，以5 mL/min流速上樣，收集流出液，按“2.1”項下方法測定血根堿質(zhì)量濃度，并按“（1）”項下方法計算CM-FF型樹脂的動態(tài)吸附量。結(jié)果，當上樣pH為5.5時，動態(tài)吸附量達峰值37.04 mg;當上樣pH過低或過高時，樹脂動態(tài)吸附量均有所下降（見圖2B）。因此，本研究確定博落回提取物溶液上樣pH值為5.5。

（3）上樣體積考察。精密稱取CM-FF樹脂適量，按“（1）”項下方法裝填離子交換制備柱，并采用2 BV含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液（pH調(diào)至5.5）對柱床進行平衡。取“2.2”項下制備的博落回提取物適量，以含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液制成質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL的溶液。取該溶液50 mL，以5 mL/min流速上樣，每5 mL收集1次流分，按“2.1”項下方法測定血根堿質(zhì)量濃度。以流分編號為橫坐標、流分中血根堿質(zhì)量濃度為縱坐標繪制動態(tài)泄露曲線（見圖2C）。結(jié)果表明，從6號流分開始出現(xiàn)明顯泄露現(xiàn)象（即可檢出血根堿成分），因此確定6.0 mg/mL的博落回提取物溶液的上樣體積為25 mL。

2.3.5 博落回提取物的動態(tài)洗脫條件考察 采用APPS 10D型液相制備系統(tǒng)實時在線監(jiān)測進行動態(tài)洗脫條件考察。根據(jù)“2.3.3”項下方法及考察結(jié)果，稱取CM-FF樹脂適量，裝填BV為20 mL的離子交換制備柱。配制含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液（pH調(diào)至5.5）作為洗脫液A相，配制含20%甲醇、0.5 mol/L氯化鈉的20 mmol/L醋酸銨溶液（pH調(diào)至5.5）作為洗脫液B相。采用2BV的A相對柱床進行平衡;將質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL的博落回提取物溶液（以A相為溶劑配制），以5 mL/min流速上樣5 min。先以A-B混合相（B相體積比為2%）、流速為5 mL/min進行洗脫，得制備液相色譜圖（見圖3）。結(jié)果顯示，從17 min開始，洗脫液色譜圖中出現(xiàn)明顯紫外吸收，表明有成分被洗脫出來;以17 min為起點，每10 mL收集1個流分，至40 min時，流出液色譜圖中已無紫外吸收，停止收集。對已收集的各流分采用“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，通過與血根堿對照品溶液的保留時間比對可知，所有已收集流分中所含成分均為雜質(zhì)。然后將混合相中的B相體積比提高至50%[此時混合洗脫液組成為含20%甲醇、0.25 mol/L氯化鈉的20 mmol/L醋酸銨溶液（pH 5.5）]繼續(xù)進行洗脫，至52 min時，洗脫液色譜圖中有明顯紫外吸收;此時起，保持上述洗脫條件，每10 mL收集1個流分，直至洗脫液無紫外吸收（見圖3）。對上述流分按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，結(jié)果第54～74 min期間洗脫物中成分為血根堿。合并這一時間段的洗脫液流分（即精提物溶液），用于進一步脫鹽和精制純化。

2.3.6 博落回精提物溶液的精制純化 為除去精提物溶液中的醋酸銨、氯化鈉等無機鹽，將“2.3.4”項下得到的精提物溶液直接上樣至反相C18制備級色譜柱中，用2 BV的20%甲醇溶液以15 mL/min流速進行脫鹽;然后以2 BV的甲醇同流速洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，得到橙紅色精制純化干燥粉末，純化收率為71%。經(jīng)HPLC法檢測，該精制純化物的純度為97%，并通過與血根堿對照品溶液的保留時間比對可初步判斷為血根堿。所得精制純化物的HPLC檢測結(jié)果見圖4。

2.4 博落回提取物精制純化物的結(jié)構確證

取“2.3”項下制備的博落回精制純化物，經(jīng)HPLC法、紫外分光光度法、質(zhì)譜法（MS）和核磁共振氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）分別檢測。結(jié)果，該化合物與血根堿對照品保留時間一致，紫外特征吸收波長分別為270、328、335（肩峰）、400、475 nm;電噴霧（ESI）-MS譜顯示，質(zhì)荷比（m/z）為332.5，與血根堿分子[C20H14NO4]+一致;1H-NMR譜（600 MHz，CD3OD）顯示，δ為9.90（1H，s，H-6）、8.57（1H，d，J=8.9 Hz，H-9）、8.48（1H，d，J=8.8 Hz，H-11）、8.17（1H，d，J=8.9 Hz，H-10）、8.11（1H，s，H-4）、7.93（1H，d，J=8.8 Hz，H-12）、7.52（1H，s，H-1）、6.53（2H，s，2，3-OCH2）、6.27（2H，s，7，8-OCH2）、4.93（3H，s，N-CH3）;13C-NMR譜（150 MHz，CD3OD）顯示，δ為150.68、150.60、150.50、149.27、147.97、133.91、132.65、128.81、127.30、121.66、121.00、119.38、118.07×2、111.00、106.79、106.35、104.79、104.14、52.64。經(jīng)與文獻數(shù)據(jù)[18]比對，最終確認博落回提取物的精制純化物為血根堿，相關譜圖詳見圖5。

3 討論

在已往相關研究中，對博落回生物堿的分離提取多針對的是生物總堿混合物[2-6]，而對于其單體生物堿的分離純化則鮮見報道。離子交換樹脂具有成本低、性能穩(wěn)定、分離速度快、環(huán)境污染少、可再生和反復使用的優(yōu)勢，廣泛應用于化工生產(chǎn)、食品工業(yè)、制藥工業(yè)和環(huán)保等領域[17-18]。本研究首次采用以瓊脂糖為基質(zhì)的軟膠CM-FF型弱陽離子交換樹脂對博落回提取物進行分離純化，并以反相C18制備柱進行脫鹽及進一步純化，最終得到純度為97%的血根堿產(chǎn)物，純化收率為71%。該工藝穩(wěn)定高效，為血根堿的開發(fā)和應用研究奠定了基礎。

陽離子交換樹脂法利用生物堿陽離子可被樹脂所吸附、中性或陰離子成分不被吸附的原理，常用來純化生物堿類成分[19]。本研究首先通過靜態(tài)吸附與解吸附試驗，對比了8種不同類型離子交換樹脂及大孔樹脂對博落回提取物中血根堿的吸附和解吸附性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CM-FF、SP-HP型這兩種瓊脂糖基質(zhì)的軟膠陽離子交換樹脂的吸附和解吸附性能較佳。其原因可能為博落回提取物中所含有的血根堿及其類似物（原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿等）均為苯并異喹啉類衍生物且都具有很強的疏水性，在與另外6種基質(zhì)為聚苯乙烯的樹脂發(fā)生相互作用時，既有較強的π-π相互作用，又有電荷相互作用，從而使血根堿難以被解吸附并洗脫;而CM-FF、SP-HP型樹脂不會與血根堿及其類似物發(fā)生疏水相互作用，而僅通過離子鍵相互作用，因此具備較好的解吸附性能[20-21]。同時，這類樹脂基質(zhì)與博落回提取物間相互作用力弱，有利于樹脂的再生和循環(huán)利用，可有效延長樹脂的使用壽命，從而降低工藝成本。而與SP-HP型強陽離子樹脂比較，CM-FF型樹脂為弱陽離子交換樹脂，易于平衡，樹脂粒徑更大，反壓低，易于裝填，更利于工業(yè)化生產(chǎn)。

在篩選出CM-FF型弱陽離子樹脂后，需要進一步考察其工作參數(shù)。考慮到弱陽離子交換樹脂一般在pH4.5～6.5范圍內(nèi)性能較好，通過本研究考察，最終篩選出最佳上樣pH值為5.5。此外，本課題組前期通過對動態(tài)流速和反壓進行比較后發(fā)現(xiàn)，流速過低，則洗脫工藝時間將會延長，不利于放大生產(chǎn);流速過高，在反壓較高的情況下，多批次使用后會造成樹脂床層的塌陷，從而導致柱效降低，無法完成分離純化。經(jīng)多次預試驗考察，優(yōu)選出工作流速為5 mL/min，在此流速下，體系的反壓為1.5 bar（1 bar=100 kPa），在軟膠樹脂的最大耐壓3 bar范圍之內(nèi)。在溶劑選擇方面，由于博落回提取物疏水性較強，為保證樣品始終處于溶解狀態(tài)，本課題組在預試驗中篩選了溶劑中甲醇的比例，結(jié)果顯示20%的甲醇比例為保持樣品完全溶解的最低甲醇用量。另外，在緩沖液體系的篩選中，考慮到20 mmol/L的醋酸銨體系具有良好的緩沖效果，最終優(yōu)選出含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液為最佳離子交換洗脫體系。后期使用APPS 10D液相制備系統(tǒng)實時在線監(jiān)測進行流分收集，再通過HPLC法監(jiān)測洗脫結(jié)果，最終確定了動態(tài)洗脫工藝及流分收集體積。對于離子交換洗脫得到的精提物鹽溶液，再使用反相C18制備柱進行脫鹽和精制純化，由圖3可見，精制純化物中的主要雜質(zhì)相對保留時間為1.79，表明其雜質(zhì)在反相體系中較易去除。

綜上所述，本研究采用離子交換工藝完成了博落回提取物中血根堿的分離純化，洗脫體系中有機溶劑的用量非常少，優(yōu)選工藝綠色環(huán)保、安全高效、易于操作，適合工業(yè)化生產(chǎn)。本研究所獲血根堿的純度為97%，今后有待進一步優(yōu)化工藝提高精制品的純度;此外，由于軟膠樹脂耐壓性較差，工作流速相對較低，造成工藝耗時較長，在今后的研究中將嘗試采用同類型高交聯(lián)度且耐壓性更強的離子交換樹脂進行分離純化。

參考文獻

[ 1 ] 王朝元，童勝蘭，胡鑫.博落回生物堿成分及其抗菌活性的研究[J].中南民族大學報（自然科學版），2015，34（1）：39-42.

[ 2 ] 余坤，彭懿，卿志星，等.博落回根的化學成分研究[J].中藥材，2016，39（8）：1767-1770.

[ 3 ] 鄒惠亮，李紅玉，周光熊.博落回的生物堿成分及細胞毒活性研究[J].中國中藥雜志，2015，40（3）：458-462.

[ 4 ] 楊鵬，卿志星，向峰.基于質(zhì)譜示蹤研究博落回根的化學成分[J].中藥材，2017，40（1）：84-86.

[ 5 ] OCH A，SZEWCZYK K，?UKASZ PECIO，et al. UPLC- MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papa- veraceae Families[J]. Oxid Med Cell Longev，2017. DOI：10.1155/2017/9369872.

[ 6 ] 葉馮芝，馮鋒，柳文媛.博落回的生物堿成分[J].中國中藥雜志，2009，34（13）：1683-1686.

[ 7 ] 汪學軍，閔長莉，韓彭壘.博落回不同部位提取物對大腸菌群的抑菌作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28：247-250、288.

[ 8 ] 高紅梅，付小草，馬林.博落回生物堿對12種植物病原菌的生物活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42（18）：5810-5812.

[ 9 ] 楊舒，劉巖，楊千帆，等.博落回抗腫瘤作用及誘導人體端粒DNA 形成G-四鏈體分子機制研究[J].中草藥，2011，42（4）：738-742.

[10] 田晶，郁建平，葛永輝.博落回中生物堿對五種皮癬真菌抑制作用的初步研究[J].中成藥，2010，32（7）：1108- 1110.

[11] 張素仙，王妍妍，張琴，等.血根堿對紫杉醇耐藥卵巢癌A2780/Taxol細胞生長及TGF-β1/Smad通路抑制的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，38（6）：717-720.

[12] 張夢雅，王春麗，杜先華，等.血根堿通過STAT3通路對LPS致RAW264.7細胞炎癥的保護作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2017，28（6）：714-718.

[13] HUANG P，XIA L，LIU W，et al. Hairy root induction and benzylisoquinoline alkaloid production in Macleaya cordata[J]. Sci Rep，2018，8（1）：11986.

[14] ESTRADA-ANGULO A，AGUILAR-HERNáNDEZ A，OSUNA-PéREZ M，et al. Influence of quaternary benzophenantridine and protopine alkaloids on growth performance，dietary energy，carcass traits，visceral mass，and rumen health in finishing ewes under conditions of severe temperature-humidity index[J]. Asian-Australas J Anim Sci，2016，29（5）：652-658.

[15] 鄭淑霞，易駿，吳巖斌，等.大孔樹脂純化蓮房總黃酮的工藝研究[J].中國藥房，2015，26（31）：4405-4408.

[16] 王忠震，林兵，宋洪濤，等.大孔吸附樹脂純化雷公藤4種有效成分的工藝研究[J].中國藥房，2016，27（16）：2261-2264.

[17] 于國慶.離子交換樹脂在天然產(chǎn)物分離純化中的應用[J].天津化工，2012，26（5）：38-40.

[18] 袁帥，劉江云，周勝.博落回血根堿的制備工藝研究[D].蘇州：蘇州大學，2018.

[19] 張小艷，黃紅梅，汪尚坤，等.博落回的進展研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（23）：157-162.

[20] 林曉彤，郭娜，周翎，等.草烏花總生物堿的純化工藝研究[J].中國藥房，2015，26（31）：4396-4398.

[21] 邱峰，呂華沖，馬驍馳.天然藥物化學[M].北京：清華大學出版社，2013：375-381.

（收稿日期：2019-03-15 修回日期：2019-07-04）

（編輯：段思怡）