馬良瓊 曾慧 羅彩霞 張威威 許鋒 程水源

摘要：法尼基焦磷酸合酶（farnesyldiphosphatesynthase，F(xiàn)PS）是三萜皂苷生物合途徑的一個關(guān)鍵酶，為研究FPS基因在枸骨中的功能，該研究采用PCR技術(shù)將一個FPS基因的cDNA序列從枸骨葉中分離出來，并命名為IcFPS1。結(jié)果表明：根據(jù)測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)擴增獲得的IcFPS1基因cDNA長度為1591bp，包含一個完整的開放閱讀框，大小為1029bp。通過序列分析發(fā)現(xiàn)枸骨IcFPS1基因編碼342個氨基酸，分子量和等電點分別為39.58kDa和5.18。通過理化性質(zhì)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)IcFPS1蛋白不含信號肽，不含有跨膜區(qū)域，該IcFPS1蛋白為親水性蛋白質(zhì)。通過序列多重比對發(fā)現(xiàn)IcFPS1蛋白質(zhì)與其他植物的FPS蛋白質(zhì)高度同源，有共同的保守區(qū)域和氨基酸序列，其中與西洋參FPS序列的相似性高達89%。通過系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)枸骨FPS蛋白與同屬于被子植物的五加科植物FPS蛋白親緣關(guān)系較近，說明FPS基因在進化過程中相對比較保守。根據(jù)蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白可能與IPP1、IPP2、GGPS3、GGPS6和ERA1相互作用，參與類異戊二烯的合成代謝過程。通過實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)IcFPS1基因在枸骨各個組織部位中均有表達，其中在枸骨根中表達量最高，在莖和雌花中表達量最低。

關(guān)鍵詞：枸骨，法尼基焦磷酸合酶，三萜皂苷，克隆，表達

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）03-0328-08

枸骨（Ilexcornuta）為冬青科灌木或喬木，四季常青，可用于綠化。同時，枸骨在傳統(tǒng)上也是常用中藥之一，枸骨根、葉、果實等組織均可入藥，在常見病痛治療方面有較好療效（彭國全等，2011）。根據(jù)《本草拾遺》記載，枸骨葉具備清熱養(yǎng)陰、補肝益腎、祛風濕等功效，在肺癆咳嗽、勞傷失血等疾病治療方面也有很好的應(yīng)用（左文健等，2011）。枸骨葉中含有許多次生代謝物質(zhì)，包括三萜及其皂苷、黃酮及其多酚類化合物（李國文等，2011）。因此枸骨具有重要的商業(yè)和藥用價值。

枸骨葉中主要成分之一的三萜皂苷是廣泛分布于人參、靈芝、三七、墨旱蓮等藥用植物中的一類重要次生代謝產(chǎn)物，屬于中藥植物的主要活性成分之一，具有抗癌、抗氧化、消炎解毒等功效（張召寶等，2015）。整個三萜生物合成過程涉及法尼基焦磷酸合酶、鯊烯合酶、鯊烯環(huán)氧酶或單加氧化酶、氧化鯊烯環(huán)化酶等一系列酶的催化。法尼基焦磷酸合酶（farnesyldiphosphatesynthase，F(xiàn)PS）是一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，它催化五碳原子的二甲丙烯基焦磷酸和異戊烯基焦磷酸以頭尾連續(xù)縮合反應(yīng)，進而形成碳原子的法尼基焦磷酸，成為植物體內(nèi)皂苷、倍半萜、甾體、橡膠等許多萜類衍生物質(zhì)的合成前體（Cunilleraetal.，1996）。至今，在洋甘菊（楊秀梅，2013）、擬南芥（Cunilleraetal.，1996）、刺五加（周秘等，2013）、絞股藍（蔣東等，2014）、三七（陳莉等，2006）等許多植物中已經(jīng)進行了FPS基因的分離和功能研究，研究結(jié)果證實FPS是植物三萜皂苷生物合成途徑的一個關(guān)鍵酶，能夠調(diào)控植物類異戊二烯途徑，促進三萜皂苷的合成。截至目前，在枸骨上尚且沒有發(fā)現(xiàn)FPS基因的研究報道，克隆FPS基因并進行功能研究是揭示FPS基因在枸骨三萜生物合成途徑中功能的前提。在本項目中，我們對枸骨FPS基因進行了克隆、對其序列進行了生物信息學(xué)分析、并進行了組織表達分析。研究結(jié)果可為弄清FPS基因在枸骨三萜類生物合成中的調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

本研究中的枸骨材料采摘于長江大學(xué)校園，收集五種不同的組織（根、莖、葉、雄花、雌花）用于RNA提取和基因表達分析，采摘的材料立即在液態(tài)氮中速凍并儲存在-80℃超低溫冰箱中待用。

1.2方法

1.2.1RNA的提取和cDNA合成將枸骨的不同器官（根、莖、葉、雄花、雌花）在液氮中磨成細粉末狀，參照PlantRNAExtractionKit（TaKaRa，MiniBEST）試劑盒說明書提取各組織總的RNA。分光光度計和瓊脂凝膠電泳檢測質(zhì)量較好的RNA用于cDNA的合成。枸骨cDNA的合成以RNA為模板，采用PrimeScriptTM的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，Dalian，China）完成。

1.2.2枸骨IcFPS1基因的克隆根據(jù)枸骨的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)設(shè)計并合成FPS基因擴增特異引物，上游引物為IcFPSF1：5′-ATTAAGACCATCTGTGGAGCCTAGC-3′，下游引物為IcFPSR1：5′-GGGTGACAGGTTTGTATAGCATCCA-3′。PCR反應(yīng)體系25μL，包括ddH2O16.5μL，10×Buffer2.5μL，MgCl22.0μL，dNTP0.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸90s，共32個循環(huán);最后72℃延伸10min，4℃結(jié)束。PCR擴增結(jié)果用1%的凝膠電泳檢測，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化擴增產(chǎn)物，純化產(chǎn)物連接到從寶生物購買的pMD19-T載體上，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中。轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細胞經(jīng)活化蘇醒后被均勻地涂抹于含有Amp的LB的培養(yǎng)皿中，挑取菌落進菌液活化，并進行菌液PCR擴增驗證，陽性結(jié)果菌液送往上海生物工程公司進行測序。

1.2.3生物信息學(xué)分析IcFPS基因cDNA序列和蛋白質(zhì)序列比對利用在線工具NCBI-blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BlAST/）完成。運用VectorNTISuitev11.5和DNAMAN8來分析IcFPS1基因的cDNA序列，進行蛋白質(zhì)翻譯。IcFPS1蛋白質(zhì)理化學(xué)性質(zhì)的分析采用工具ProtParamtool（http：//web.expasy.org/protparam/）進行。信號肽預(yù)測、疏水性分析、跨膜區(qū)域預(yù)測分別用在線工具SignalP4.1Server、ProtScale和TMHMMServerv.2.0完成。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析借助SOPMA工具實現(xiàn)。利用軟件AlignX（VectorNTISuiteV11.5）對多種植物的FPS蛋白進行多重比對分析，利用ClustalX2.0和MEGA6.0軟件采用鄰接（NJ）方法構(gòu)建FPS基因系統(tǒng)進化樹，使用Bootstrap對系統(tǒng)樹可信性進行檢驗，重復(fù)1000次。應(yīng)用STRING交互式數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）構(gòu)建候選蛋白與相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析預(yù)測IcFPS1蛋白在互作網(wǎng)絡(luò)中的作用關(guān)系，保留可信度大于0.700相互作用關(guān)系，用Cytoscape3.61調(diào)整展示互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4實時熒光定量PCR分析使用RNA提取試劑盒（PlantRNAExtractionKit）從五種不同的組織器官樣品中提取總RNA。根據(jù)IcFPS1基因的cDNA序列設(shè)計實時熒光定量引物，上游引物為IcFPSRT-S：5′-ACAGATTACCGAAGGTTGGTATG-3′，下游引物為IcFPSRT-A：5′-GGTTGTCTGGAATTCTACCTCATTA-3′。qRT-PCR內(nèi)參基因選用的是IcGAPDH，上游引物序列IcGAPDH-S：5′-TATCAACGGCTTCGGTCGCA-3′，下游引物序列IcGAPDH-A：5′-GGACGGAGTCGTACTTGAGCAT-3′。引物送往上海生工生物技術(shù)有限公司合成。實時熒光定量PCR在杭州博日科技有限公司的Linegene9600PCR儀上進行，反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR的操作依照試劑盒PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser和SYBRRPremixExTaqTMII的操作步驟說明書逐步進行。反應(yīng)程序為95℃、30s，95℃、5s;60℃、30s，共40個循環(huán)。每種樣品三次取樣重復(fù)，三次技術(shù)重復(fù)，并分別設(shè)置一個陰性對照（模板為ddH2O）。IcFPS1基因的相對表達水平計算通過使用2-ΔΔCt法完成（Livak&Schmittgen，2001）。

2結(jié)果與分析

2.1IcFPS1基因cDNA克隆與序列分析

利用特異性引物，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，通過PCR技術(shù)從枸骨中克隆得到一條FPS基因序列，通過NCBI網(wǎng)站的在線程序Blast比對分析顯示該cDNA序列與其他物種的FPS基因序列具有較高的相一致性，克隆獲得的cDNA序列為枸骨的FPS基因，命名為IcFPS1。此cDNA序列長度為1591bp，包含1029bp的開放閱讀框，編碼342個氨基酸（圖1）。

2.2枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析

IcFPS1蛋白質(zhì)含有342個氨基酸。在線網(wǎng)站分析表明，IcFPS1蛋白質(zhì)的分子量和等電點分別為39.58kDa和5.18。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為33.87，該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白。SignalP4.1Server信號肽預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)IcFPS1蛋白不含有信號肽，蛋白質(zhì)疏水性分析顯示IcFPS1為親水蛋白。蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域分析結(jié)果表明，IcFPS1蛋白不含有跨膜區(qū)域。通過SOPMA工具分析該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果表明IcFPS1蛋白主要由α螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)組成，其所占比例分別為65.5%、24.56%、6.73%和3.22%。同源比對分析通過在線工具BlASTP（NCBI）和AlignX（VetctorNTI11.5）完成。用NCBI的ConservedDomainSearch工具分析蛋白質(zhì)保守域，結(jié)果顯示IcFPS1蛋白質(zhì)屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超級家族的成員，含有Polyprenylsynthetase保守區(qū)域（圖2下劃線區(qū)域），表明IcFPS1參與類異戊二烯的生物合成。

2.3枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)的同源比對

同源比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)與其他植物的FPS蛋白質(zhì)相似性較高（圖2）。其中枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)和西洋參（ADJ68004）、人參（AAY87903）、常春藤（APV45530）、龍牙楤木（ADK12004）、積雪草（AAV58896）、白樺（AKQ62666）、野茶樹（ANA11766）、刺五加（AEY77151）和纈草（AIU63880）的FPS蛋白質(zhì)之間的相似性比分別為89%、88%、87%、87%、87%、87%、87%、87%和86%。不同物種之間FPS蛋白有較高的一致性，暗示在功能上可能也是相同或相似的。

2.4IcFPS1蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分析

系統(tǒng)進化樹采用ClustaIX2.0和MEGA6.0軟件構(gòu)建的，目的是進一步探索FPS蛋白質(zhì)在不同物種之間的進化關(guān)系。如圖3所示，所有的FPS蛋白都來自于一個共同的祖先，不同物種的FPS蛋白質(zhì)也被清晰地歸類到三個分支，分別為植物、動物和真菌（圖3）。系統(tǒng)進化樹分析顯示枸骨FPS1蛋白與被子植物界雙子葉植物五加科的FPS蛋白親緣關(guān)系最近，聚類在同一分支上;而薔薇科的玫瑰、梅、白梨的FPS蛋白聚類到另一分支上。該結(jié)果表明，F(xiàn)PS1蛋白可能與五加科的FPS蛋白質(zhì)在功能上更為接近。枸骨IcFPS1在功能上也可能與五加科植物的FPS蛋白相同，參與調(diào)控三萜皂苷的合成代謝。

2.5枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING蛋白互作數(shù)據(jù)庫對枸骨IcFPS1蛋白進行相互作用分析，物種參數(shù)選擇模式植物擬南芥，構(gòu)建了的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖4）。IcFPS1蛋白可以與10個蛋白互作，其中IPP1、IPP2、GGPS3、GGPS6和ERA1都是植物類異戊二烯合成途徑的調(diào)節(jié)酶，該互作網(wǎng)絡(luò)表明枸骨IcFPS1蛋白可能與這些蛋白存在一些相似的功能，或共同參與植物類異戊二烯的合成代謝過程。

2.6IcFPS1的組織表達分析

為了研究IcFPS1基因的各個組織器官的表達水平，提取枸骨的根、莖、葉、雄花、雌花的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，利用qRT-PCR技術(shù)測定枸骨各組織器官中IcFPS1基因的表達水平。qRT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IcFPS1基因在各個組織器官中都有表達。其中在枸骨根中的基因表達量最高，葉中表達量次之，雄花中較低，在莖和雌花中的表達量最低（圖5）。枸骨的主要藥用部位是根和葉片，本研究中IcFPS基因也在這兩個部位中表達量較高。因此，推測IcFPS基因可能參與了枸骨三萜類物質(zhì)的生物合成調(diào)控，是枸骨三萜皂苷合成代謝中的一個關(guān)鍵酶基因。

3討論與結(jié)論

FPS參與類異戊二烯生物合成途徑，屬于植物次生代謝三萜皂苷與甾醇合成途徑中的一個限速酶，也是三萜皂苷合成生物學(xué)研究的其中一個重要酶。本研究克隆得到枸骨的IcFPS1基因，對其進行了生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測。結(jié)果表明，IcFPS1蛋白質(zhì)屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超級家族，與其他植物尤其是藥用植物的FPS蛋白質(zhì)具有較高的相似性，與五加科的FPS蛋白親緣關(guān)系較近，結(jié)合蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，證實枸骨IcFPS1參與類異戊二烯代謝途徑，可能參與調(diào)控枸骨三萜皂苷的生物合成。

qRT-PCR分析結(jié)果表明IcFPS1基因在枸骨各個器官組織中的表達量具有部位差異性，其中在根中的基因表達量最高，其次是葉，在莖和雌花中表達量最少，這種現(xiàn)象或許與FPS在三萜皂苷代謝途徑中的功能有關(guān)。目前已在許多植物上進行了FPS基因的分離和功能驗證。Cunilleraetal.（1996）克隆了擬南芥FPS基因，qRT-PCR分析結(jié)果表明擬南芥FPS1和FPS2基因在幼苗的根、莖、葉和花中都有表達;其中，F(xiàn)PS1基因在根和花中最高表達，F(xiàn)PS2基因表達水平較低，具有組織表達差異性，這與我們的研究結(jié)果相似。在白木香FPS基因功能研究中，組織表達結(jié)果表明FPS基因的表達量最高是根，其次是莖，表達量最少的是葉，推測該基因在根和莖兩個組織中發(fā)揮生物學(xué)功能，與白木香的形成部位相關(guān)（楊欣等，2013）;在人參中，F(xiàn)PS基因表達分析結(jié)果表明該基因在葉的表達量最多（楊林林等，2017），這與本文研究中根的表達量最多不同。在三七FPS基因的功能研究時發(fā)現(xiàn)，在三七細胞中過表達FPS基因可以促進三七總皂苷積累（楊延等，2015）。周秘等（2013）對刺五加法尼基焦硫酸合酶研究發(fā)現(xiàn)，PFS基因刺五加整個發(fā)育時期的表達量與其皂苷含量呈現(xiàn)基本相似的變化趨勢，證實FPS是刺五加三萜皂苷生物合成的一個關(guān)鍵酶。這些結(jié)果表明FPS基因的表達與三萜化合物的生物合成密切相關(guān)。因此可以推斷，枸骨的IcFPS1基因也可能參與了枸骨三萜類物質(zhì)的生物合成。

總之，本研究克隆獲得了枸骨的IcFPS1基因，對其核酸序列和蛋白質(zhì)進行了生物信息學(xué)分析預(yù)測，構(gòu)建了枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò);并分析了IcFPS1基因在枸骨不同組織部位中的表達水平，該研究為進一步弄清IcFPS1基因在枸骨三萜皂苷生物合成中的作用奠定了基礎(chǔ)，為提高枸骨三萜皂苷含量提供了一定的理論依據(jù)。

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