葉 英,李宗仁,曹效海,院珍珍,喬楊波,王樹林,*

(1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室,青海西寧 810016; 2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海西寧 810016)

狹果茶藨子(RibesstenocarpumMaxim.)屬虎耳草科茶藨子屬植物,為落葉灌木,生于海拔2800 m以下的山坡灌叢、雜木林下或山溝中[1]。茶藨子屬植物形態(tài)變異較大,類型復(fù)雜,全世界約有160種,主要分布于歐洲和北美氣候溫暖地區(qū),在亞洲、南美和北非也分布廣泛,中國境內(nèi)有59種30個變種,僅青海省就分布有11種1個變種[2-3]。《涼山州中草藥資源普查名錄》記載狹果茶藨子的莖和枝可用于肝炎的治療[1],《晶珠本草》中記載茶藨子有斂毒、除黃水及收斂各種脈管病的作用[4]。狹果茶藨子的果實為多汁漿果,風(fēng)味獨特多樣,從苦、酸到酸甜可口,老百姓通常將茶藨子的果實生食用于防治感冒,嫩葉沖飲代茶用,具有清熱解毒、清肝明目、抗菌等功效[5],其根泡酒用于治療風(fēng)濕病[6]。茶藨子果實營養(yǎng)豐富,含酒石酸、檸檬酸、蘋果酸等有機酸及糖類等[6],而且果實加工性能好,是開發(fā)功能性食品的理想原料。

茶藨子植物在歐美地區(qū)早已人工栽培并培育出不少優(yōu)良品種[7],國內(nèi)外對該屬植物已報道的化學(xué)成分主要有花青素類[8]、黃酮類[9]、有機酸類[10]、多酚類[11]以及β-carboline類生物堿[12]。我國茶藨子屬植物資源豐富,在青海、貴州、四川、新疆、吉林等地廣泛分布[13],但都處于野生狀態(tài),大部分無人問津,研究和開發(fā)緩慢,近幾年有關(guān)茶藨子產(chǎn)品開發(fā)的文獻(xiàn)報道寥寥無幾,已有的相關(guān)活性研究也是屈指可數(shù),袁鳳蓮[14]報道了新疆茶藨子茶的藥理作用及加工;賈健輝等[15]研究了以山藥和東北茶藨子為主要原料的復(fù)合飲料。杜偉偉[16]對不同時期香茶藨子葉片粗提物進(jìn)行抗腫瘤活性測試,發(fā)現(xiàn)其對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖有較好的抑制作用;鄒維娜等[17]對香茶藨子葉片總酚及總黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,并發(fā)現(xiàn)其總酚及總黃酮具有較好的抗氧化活性;李靜等[18]研究了五裂茶藨子葉的化學(xué)成分及其抗炎活性,發(fā)現(xiàn)6個黃酮類化合物對炎癥因子有不同程度的抑制作用。

青藏高原茶藨子植物資源分布廣泛,營養(yǎng)價值高且綠色無污染,但尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究和開發(fā)利用[13],有關(guān)其生物活性的研究更是未見報道。狹果茶藨子果實在青藏高原具有較長的食用歷史,當(dāng)?shù)匕傩沼闷浞乐胃忻?推測其機制可能與較強的抗菌活性有關(guān)。在天然植物化學(xué)成分中,有機酸與黃酮類化合物往往具有較強的抑菌作用[19-22]。本論文以青藏高原分布較多的狹果茶藨子果實為原料,采用K-B紙片擴散法和試管二倍稀釋法首次研究狹果茶藨子果實中不同提取物的抑菌作用,并測定總有機酸和總黃酮含量,同時通過小鼠負(fù)重游泳實驗對其抗疲勞活性進(jìn)行評價,以期為青藏高原狹果茶藨子功能性食品的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

狹果茶藨子果實 采自青海省互助縣,烘干粉碎后過60目篩備用;實驗動物為SPF級昆明種小鼠(雄性,體重18～22 g) 購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,生產(chǎn)許可證號為SCXK(甘)2015-0001,實驗動物使用許可證號為SYXK(青)2017-0002;大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(S.typhi)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、白色念珠菌(C.albicans)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、氨芐西林藥敏片(10 IU/片)、慶大霉素藥敏片(10 IU/片)、青霉素(10 IU/片)藥敏片、MH瓊脂、MH液體培養(yǎng)基 杭州百思生物技術(shù)有限公司;肌糖原(MG)試劑盒、肝糖原(LG)試劑盒、血清尿素氮(BUN)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒 南京建成生物工程研究所;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 合肥博美生物科技有限公司;無水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等(分析純) 天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

KC-130小型粉碎機 北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;250B生化培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司;YM-75立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;UV-2600紫外可見分光光度計 島津企業(yè)管理有限公司;SC2201勻漿機 上海小巖工貿(mào)發(fā)展有限公司;XW-80A旋渦混勻器 上海馳唐電子有限公司;H/T16MM-臺式高速離心機 湖南赫西裝備儀器有限公司;SM600酶標(biāo)儀 上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司;DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;14-0807超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;ESJ110-4B電子天平 沈陽龍騰電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 狹果茶藨子果實不同粗提物的制備

1.2.1.1 有機酸提取物Ⅰ的制備 參考陳琦等[23]方法并加以改進(jìn)。稱取100 g狹果茶藨子果實樣品,加入75%乙醇浸泡1 h,于索氏提取器中加熱回流提取兩次,每次2～3 h,冷卻后抽濾,收集濾液并濃縮至無醇味后加入5%氫氧化鈉溶液調(diào)pH至11,用乙酸乙酯反復(fù)萃取溶液至無色,收集堿水層,5%鹽酸調(diào)pH至2,再用乙酸乙酯反復(fù)萃取至無色,合并萃取液,減壓回收溶劑,烘干,得有機酸提取物Ⅰ。

1.2.1.2 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的制備 稱取一定量的狹果茶藨子果實樣品,90%乙醇加熱回流提取三次,收集濾液,濾渣再用70%乙醇提取三次,過濾合并所有濾液,濃縮后用石油醚萃取,棄去石油醚層,用乙酸乙酯萃取水相,濃縮有機相,得乙酸乙酯萃取物Ⅱ,水相再用正丁醇萃取,濃縮正丁醇層,烘干,得正丁醇萃取物Ⅳ。乙酸乙酯萃取物Ⅱ過聚酰胺樹脂,依次用2倍柱體積的蒸餾水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和無水乙醇洗脫,然后將樹脂倒出,用2%鹽酸浸泡樹脂2 h,蒸餾水洗至中性,再加入2%氫氧化鈉溶液浸泡2 h,過濾收集濾液,濃縮,烘干,得到乙酸乙酯萃取物Ⅲ。

1.2.2 不同粗提物中總有機酸含量測定 分別稱取狹果茶藨子果實不同粗提物0.5 g,50%乙醇溶解并定容至50 mL,吸取10 mL于250 mL錐形瓶中,加1%酚酞指示劑2滴,用0.1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定至中性,記錄氫氧化鈉溶液用量,根據(jù)下列公式計算總有機酸含量,重復(fù)三次取平均值。

總有機酸含量(%)=(C×V×40×K)/(m×10/50)×100

式(1)

式中:V-滴定消耗氫氧化鈉溶液體積(mL);C-氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mol/L);m-樣品質(zhì)量(g);K-換算成主要酸的系數(shù)(即1毫摩爾氫氧化鈉相當(dāng)于主要酸的系數(shù),茶藨子為漿果,采用酒石酸計，K=0.075)。

1.2.3 不同粗提物中總黃酮含量測定

1.2.3.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 用80%乙醇溶解蘆丁對照品10 mg,定容至25 mL,準(zhǔn)確吸取對照品0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL分別置于10 mL容量瓶中,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法[24]測定各溶液的吸光度值,以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:y=30.421x+0.1623,R2=0.9952。

1.2.3.2 樣品中總黃酮含量測定 分別稱取狹果茶藨子果實不同提取物0.1 g,80%乙醇溶解后定容至50 mL,吸取0.5 mL樣品于10 mL容量瓶中,加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL靜置6 min,加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL靜置6 min,再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL,待充分反應(yīng)后用蒸餾水定容,于356 nm處測定樣品溶液的吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及下列公式計算樣品的總黃酮含量。

總黃酮含量(%)=(C×K×V)/M×100

式(2)

式中:C-測定的不同吸光度值所對應(yīng)的樣品總黃酮濃度(mg/mL);K-稀釋倍數(shù);V-移取稀釋后的樣品溶液體積(mL);M-稱取的樣品質(zhì)量(g)。

1.2.4 狹果茶藨子果實不同粗提物的抑菌活性研究

1.2.4.1 菌種活化及菌懸液的制備 選取大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌作為受試菌種,取MH瓊脂9.5 g,加入蒸餾水250 mL,攪拌加熱煮沸至完全溶解,121 ℃高壓滅菌15 min,冷卻至55～65 ℃,攤成斜面,放入恒溫箱37 ℃空白培養(yǎng)48 h,經(jīng)檢查無雜菌后在無菌操作下移接上述各菌種,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。從斜面挑取3～5個形態(tài)相似的菌落頂端部分接種至MH液體培養(yǎng)基制備菌懸液,37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h,滅菌生理鹽水稀釋培養(yǎng)液,用麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷嶂?.5麥?zhǔn)蠁挝?MCF),此時細(xì)菌濃度近似為1.5×108/mL。

1.2.4.2 藥敏片的制備 分別稱取5 g不同粗提物,50%乙醇水浴加熱使溶解,調(diào)整藥液濃度分別為100、200、300 mg/mL,將滅菌空白藥敏片浸入不同濃度藥液中,浸泡12 h后烘干備用。

1.2.4.3 K-B紙片擴散法測定不同粗提物的抑菌作用[25]將熔化并滅菌的瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50 ℃倒平板備用,棉簽蘸取菌懸液均勻涂布培養(yǎng)基,反復(fù)幾次,每次將平板旋轉(zhuǎn)60°。用鑷子將浸有不同濃度粗提物的藥敏片分別貼于培養(yǎng)基表面,用鑷尖壓平,以50%乙醇浸泡過的藥敏片作為空白對照以排除溶劑干擾,以氨芐西林(10 IU/片)、慶大霉素(10 IU/片)、青霉素(10 IU/片)藥敏片為陽性對照,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,游標(biāo)卡尺測量菌落直徑,十字交叉測量,測量三次,取平均值。

1.2.4.4 二倍稀釋法測定最小抑菌濃度和最低殺菌濃度[26]配制200 mg/mL的狹果茶藨子果實不同粗提物,分別取1 mL的不同提取物和已滅菌的液體培養(yǎng)基于試管中,混合均勻,以對倍稀釋法逐管稀釋藥液,再加入等體積的稀釋級菌液至各抑菌管,搖勻,使不同粗提物終濃度為50、25、12.5、6.25、3.13、1.56 mg/mL,并設(shè)置空白對照,將各試管置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

最低抑菌濃度(MIC)的判定:觀察培養(yǎng)后各試管的渾濁情況,試管澄清且搖勻后仍澄清者,認(rèn)為該管無菌生長,若試管內(nèi)呈渾濁狀態(tài)則表明有菌生長,從無菌生長試管中找出最低濃度試管,其所對應(yīng)的藥液濃度即為最低抑菌濃度。

最低殺菌濃度(MBC)的判定:依次將未見細(xì)菌生長的各管移取適量液體均勻涂布于固體培養(yǎng)基平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h,以平板上菌落數(shù)少于5個的最小藥液濃度作為最低殺菌濃度(MBC)。

1.2.5 狹果茶藨子果實抗疲勞活性研究

1.2.5.1 動物分組與給藥 取實驗小鼠40只,按照12 h光照,12 h黑暗的飼養(yǎng)周期,將小鼠置于溫度(24±1) ℃、濕度40%±2%的環(huán)境下在鼠籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,期間以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物標(biāo)準(zhǔn)提供所需的食物和蒸餾水,并按照實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。實驗第一周對小鼠進(jìn)行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練,一周兩次,每次10 min,將未學(xué)會游泳的小鼠淘汰。小鼠隨機分為空白對照組(雙蒸水)、紅景天陽性對照組(100 mg/kg)、乙酸乙酯提取物Ⅱ高劑量組(200 mg/kg)、乙酸乙酯提取物Ⅱ中劑量組(100 mg/kg)、乙酸乙酯提取物Ⅱ低劑量組(50 mg/kg)共五組,每組8只,每天定時、定量灌胃一次,連續(xù)灌胃28 d,灌胃飼養(yǎng)期間小鼠自由飲水、進(jìn)食,每7 d測定小鼠體重一次。

1.2.5.2 小鼠負(fù)重游泳試驗 參照Han等[27]的研究進(jìn)行小鼠負(fù)重游泳試驗。小鼠喂養(yǎng)4周并末次灌胃給藥30 min后,在小鼠尾部纏繞質(zhì)量約為其體重5%的鉛皮進(jìn)行負(fù)重游泳,水深40 cm,水的溫度保持在(25±1) ℃。記錄小鼠自游泳開始至小鼠頭部全部浸入水中且8 s不能重新浮出水面的時間,作為小鼠的負(fù)重游泳時間。

1.2.5.3 小鼠臟器濕重及各生化指標(biāo)的測定 小鼠負(fù)重游泳離水休息30 min,眼球采血后脫頸椎處死,解剖取出心、肝、脾、腎,用生理鹽水漂洗,稱取重量后記錄濕重數(shù)據(jù)。采集的血液分離血清,分別按試劑盒說明書測定血清尿素氮(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)含量。解剖取出肝臟和后腿肌肉,按試劑盒說明處理樣品并測定肝糖原、肌糖原含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總有機酸含量的測定

由表1可知,狹果茶藨子果實不同極性部位中總有機酸的含量有差異,有機酸提取物Ⅰ中有機酸含量最高,為4.18±0.04 mg/g,正丁醇萃取物Ⅳ的有機酸含量最少,為0.66±0.01 mg/g,有機酸提取物與乙酸乙酯萃取物中總有機酸含量有顯著性差異(p<0.05),兩種乙酸乙酯萃取物中有機酸含量差異不顯著(p>0.05),而乙酸乙酯萃取物與正丁醇萃取物中總有機酸含量差異顯著。乙酸乙酯萃取物Ⅱ在大孔吸附樹脂柱層析過程中有機酸主要吸附于聚酰胺樹脂,且后期通過堿水洗脫可有效回收大部分有機酸,達(dá)到有機酸初步富集純化的目的。

表1 不同粗提物的有機酸含量測定結(jié)果Table 1 Results of determination of organic acid content of different extractions

2.2 總黃酮化合物含量的測定

由表2可知,黃酮化合物主要存在于乙酸乙酯萃取物Ⅱ、乙酸乙酯萃取物Ⅲ和正丁醇萃取物Ⅳ中,分布于狹果茶藨子果實中的黃酮化合物極性差異較大。其中乙酸乙酯萃取物Ⅱ與正丁醇萃取物Ⅳ中總黃酮含量差異不顯著,而與乙酸乙酯萃取物Ⅲ中黃酮含量差異顯著(p<0.01),表中數(shù)據(jù)顯示乙酸乙酯萃取物Ⅱ經(jīng)聚酰胺樹脂處理后總黃酮含量有所下降,由此也說明聚酰胺樹脂雖可用于狹果茶藨子果實中總黃酮的初步分離,但是黃酮總量有損耗,推測有一部分黃酮化合物可能以較強的氫鍵作用力吸附于聚酰胺樹脂。

表2 不同粗提物中總黃酮化合物含量測定結(jié)果Table 2 Results of determination of total flavonoids content of different extractions

2.3 不同提取物的抑菌活性測定

2.3.1 K-B紙片擴散法實驗 由表3～表5可知,狹果茶藨子果實中不同粗提物對受試菌種抗菌活性具有較大差異,其中乙酸乙酯萃取物Ⅱ和乙酸乙酯萃取物Ⅲ對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及銅綠假單胞菌抗菌活性較為突出,當(dāng)粗提物濃度為100 mg/mL時,抑菌圈直徑均大于15 mm,表現(xiàn)為高敏,抑菌效果優(yōu)于陽性對照藥氨芐西林(10 IU/片),且抑菌活性隨藥液濃度的增大而增強,當(dāng)粗提物濃度達(dá)到300 mg/mL時,對上述三種菌的抑菌圈直徑均大于20 mm,表現(xiàn)為極敏,且抑菌效果優(yōu)于陽性對照藥青霉素(10 IU/片)。此外,有機酸提取物Ⅰ對白色念珠菌和銅綠假單胞菌抑制效果也不錯,濃度為300 mg/mL時優(yōu)于陽性對照藥青霉素(10 IU/片),濃度為100、200 mg/mL時其對白色念珠菌的抑制效果分別與氨芐西林(10 IU/片)和慶大霉素(10 IU/片)相當(dāng),對銅綠假單胞菌的抑制效果則優(yōu)于這兩種陽性對照藥?？傮w而言,有機酸提取物Ⅰ、乙酸乙酯萃取物Ⅱ和乙酸乙酯萃取物Ⅲ抑菌效果相對正丁醇萃取物Ⅳ效果要好,這與四種粗提物中總有機酸的含量變化較為相近,而與黃酮含量變化趨勢關(guān)聯(lián)不大,因此推測有機酸可能是其發(fā)揮抑菌活性的主要化合物。

表3 粗提物濃度為100 mg/mL時的抑菌圈直徑(mm)Table 3 The diameter of the antibacterial ring of extractions at the concentration of 100 mg/mL(mm)

表4 粗提物濃度為200 mg/mL時的抑菌圈直徑(mm)Table 4 The diameter of the antibacterial ring of extractions at the concentration of 200 mg/mL(mm)

表5 粗提物濃度為300 mg/mL時的抑菌圈直徑(mm)Table 5 The diameter of the antibacterial ring of extractions at the concentration of 300 mg/mL(mm)

2.3.2 MIC和MBC值的測定 由表6、表7可知,狹果茶藨子果實中不同粗提物對不同菌種的MIC和MBC值有差異,其中有機酸提取物Ⅰ和乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)Π咨钋蚓豌~綠假單胞菌抗菌活性最好,且MIC值均為1.56 mg/mL,MBC值均為3.13 mg/mL。以上試驗結(jié)果表明,狹果茶藨子果實提取物具有較好的抗菌活性,此次測試對象為狹果茶藨子果實粗提物,如若將提取物進(jìn)一步分離純化,有望得到抗菌活性更強的化合物進(jìn)而開發(fā)出新的抗菌劑,關(guān)于狹果茶藨子果實抗菌活性物質(zhì)基礎(chǔ)及抗菌作用機制有待進(jìn)一步深入研究。

表6 不同粗提物對白色念珠菌MIC和MBC值測定結(jié)果Table 6 MIC and MBC of different extractions to C.albicans

表7 不同粗提物對銅綠假單胞菌MIC和MBC值測定結(jié)果Table 7 MIC and MBC of different extractions to P.aeruginosa

2.4 狹果茶藨子果實中乙酸乙酯萃取物Ⅱ抗疲勞活性試驗結(jié)果

2.4.1 乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)π∈篌w重的影響 表8所示為飼喂過程中各組小鼠的體重變化,結(jié)果顯示:灌服狹果茶藨子果實乙酸乙酯萃取物Ⅱ不同劑量組小鼠體重與空白對照組相比均無顯著差異,給藥28 d后,各劑量組小鼠體重變化與空白對照組無顯著差異(p>0.05),說明狹果茶藨子果實乙酸乙酯萃取物Ⅱ不會對小鼠體重造成影響。

表8 乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)π∈篌w重的影響Table 8 Effects of ethyl acetate extract Ⅱ on body weight of

2.4.2 乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)π∈笈K器濕重的影響 表9所示,灌服不同濃度的狹果茶藨子乙酸乙酯萃取物Ⅱ 28 d后,解剖稱量各組小鼠臟器濕重,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn),各劑量組小鼠臟器濕重與空白對照組均無顯著差異(p>0.05),表明灌服不同劑量的狹果茶藨子乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)π∈笈K器重量無明顯影響。

表9 乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)π∈笈K器濕重的影響Table 9 Effects of ethyl acetate extract Ⅱ on wet weight of mice

2.4.3 乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)π∈筘?fù)重游泳時間的影響 如表10所示,與空白對照組相比,灌服狹果茶藨子果實乙酸乙酯萃取物Ⅱ不同劑量組小鼠的負(fù)重游泳時間均顯著延長(p<0.05),低劑量組的小鼠游泳時間最長(196.55±4.19) min,與紅景天陽性對照組相當(dāng),隨著灌胃劑量增加,小鼠負(fù)重游泳時間反而降低,這可能與小鼠個體差異有關(guān),也可能乙酸乙酯萃取物Ⅱ低劑量是其發(fā)揮抗疲勞活性的最佳劑量,有關(guān)劑量與抗疲勞活性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

表10 乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)π∈?負(fù)重游泳時間的影響Table 10 Effects of ethyl acetate extract Ⅱ on weight-bearing swimming time in

總的來說,狹果茶藨子果實乙酸乙酯萃取物Ⅱ能顯著延長小鼠負(fù)重游泳時間,減少疲勞狀態(tài)。

2.4.4 乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)π∈筇窃笜?biāo)的影響 表11所示,灌服狹果茶藨子果實乙酸乙酯萃取物Ⅱ低、中劑量實驗組的小鼠運動后肝糖原、肌糖原水平顯著高于空白組(p<0.05),且低劑量組、中劑量組糖原水平均高于紅景天陽性對照組,說明狹果茶藨子果實乙酸乙酯萃取物Ⅱ能明顯提高小鼠的糖原儲備能力,提高運動過程中糖代謝能力,改善運動耐力進(jìn)而增強小鼠的抗疲勞活性。

表11 乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)π∈筇窃挠绊慣able 11 Effects of ethyl acetate extract Ⅱ on the glycogen content in exhaustive swimming

2.4.5 乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)π∈笱逯笜?biāo)的影響 表12所示,與空白對照組相比,給藥28 d后狹果茶藨子果實乙酸乙酯萃取物Ⅱ不同劑量組的小鼠血清尿素氮均極顯著降低(p<0.01),低劑量組BUN含量僅為(4.65±1.36) mmol/L,其含量降低到空白對照組的一半以下,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于紅景天陽性對照組,運動過程中血清尿素氮水平的降低表明小鼠蛋白質(zhì)和氨基酸代謝減少,顯示出良好的運動適應(yīng)性。此外,不同劑量給藥組與空白對照組相比,小鼠乳酸脫氫酶水平均明顯提高,其中低劑量組差異極顯著(p<0.01),含量為(400.72±97.35) U/L,高于紅景天陽性對照組,說明狹果茶藨子果實中乙酸乙酯萃取物Ⅱ可提高運動后小鼠乳酸脫氫酶活性,將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸,加速乳酸清除,從而延緩小鼠運動性疲勞。

表12 乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)π∈笱逯笜?biāo)的影響Table 12 Effects of ethyl acetate extract Ⅱ on serum biochemical parameters of

3 結(jié)論

通過制備狹果茶藨子果實不同粗提物,并對其抗菌活性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)狹果茶藨子果實中乙酸乙酯萃取物Ⅱ和乙酸乙酯萃取物Ⅲ對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及銅綠假單胞菌抗菌活性較為突出,當(dāng)粗提物濃度為100 mg/mL時,乙酸乙酯萃取物Ⅱ?qū)Π咨钪榫种菩Ч詈?抑菌圈直徑達(dá)20 mm,表現(xiàn)為極敏,此時粗提物中總有機酸和總黃酮含量分別為(2.30±0.1)、(2.28±0.02) mg/g,抑菌圈試驗效果比陽性對照藥氨芐西林(10 IU/片)好,且其抑菌效果隨藥液濃度的升高而增強。抑菌實驗結(jié)果與粗提物中總有機酸含量變化趨勢較為接近,推測有機酸可能是其發(fā)揮抑菌活性的主要物質(zhì),此外本論文抗菌活性測試對象是狹果茶藨子果實粗提物,化合物純度不高,如果進(jìn)一步分離提純,有望開發(fā)出新的抗菌劑或防腐劑。

小鼠負(fù)重游泳試驗顯示狹果茶藨子果實具有良好的抗疲勞活性。與空白對照組相比,狹果茶藨子果實中乙酸乙酯萃取物Ⅱ各劑量組均能顯著延長小鼠負(fù)重游泳時間(p<0.05),提高小鼠肌糖原、肝糖原儲備能力,增強乳酸脫氫酶活性,同時降低血清尿素氮含量,有效緩解小鼠運動性疲勞,且試驗效果優(yōu)于紅景天陽性對照組。紅景天是藏醫(yī)常用藥,具有良好的耐缺氧和抗疲勞功能作用[28-29],有“高原人參”之稱,在我國使用歷史悠久,已被廣泛用于治療高原病及心腦血管疾病等,本實驗中狹果茶藨子果實乙酸乙酯萃取物抗疲勞活性優(yōu)于紅景天,可見其具有良好的開發(fā)利用價值,應(yīng)用前景廣闊。青藏高原地區(qū)高寒缺氧,推測狹果茶藨子果實良好的抗疲勞活性可能與其耐缺氧環(huán)境適應(yīng)性有關(guān),具體有關(guān)作用機制有待進(jìn)一步深入研究。

此外,研究發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取物為狹果茶藨子果實發(fā)揮其抗菌活性及抗疲勞活性的有效部位,為后續(xù)有關(guān)活性物質(zhì)的分離提取及產(chǎn)品開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。青藏高原茶藨子植物資源豐富,分布廣泛,但均為野生狀態(tài),本論文的研究可為狹果茶藨子天然防腐劑及抗疲勞功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù),促進(jìn)該屬植物資源的開發(fā)利用。