呂丹丹,毛曉英

(石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000)

核桃具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理活性,位列世界四大堅(jiān)果之首[1],在堅(jiān)果類食物中深受人們的喜愛(ài)。核桃仁蛋白質(zhì)含量達(dá)8%～24%,并含有18種氨基酸,其必需氨基酸種類、含量與人體所需相近,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富且含量均衡,是一種對(duì)人體有益的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源[2-3]。在核桃果仁中除了含有豐富的蛋白質(zhì)外,還含有1.85%～2.75%的多酚[4]。Yang等[5]研究結(jié)果表明,北美地區(qū)的9種主食堅(jiān)果中核桃果仁的總酚含量最高。流暢等[6]證實(shí)核桃在15種富含油脂的天然類食品中多酚含量最高。植物多酚是植物體中相對(duì)分子質(zhì)量在500～3000范圍內(nèi)的具有多元酚結(jié)構(gòu)的重要次生代謝產(chǎn)物。核桃多酚主要包括酚酸類、黃酮類、縮合單寧和水解單寧[7]。

在食品生產(chǎn)加工等環(huán)節(jié)中,蛋白質(zhì)等生物大分子都不可避免地受到來(lái)自多酚物質(zhì)的影響。多酚因含酚羥基的化學(xué)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)分子由于存在多種不同功能的基團(tuán),使得多酚與蛋白質(zhì)之間通過(guò)非共價(jià)作用包括氫鍵、離子鍵、疏水相互作用等這些相對(duì)較弱的作用類型相結(jié)合。共價(jià)作用主要是在堿性有氧環(huán)境下酚類化合物氧化形成相應(yīng)的醌類,進(jìn)而與蛋白質(zhì)鏈中的氨基酸殘基反應(yīng)[8-10],共價(jià)鍵理論是多酚與蛋白相互作用研究過(guò)程中提出的一種成鍵理論,對(duì)秈稻谷殼[11]、油菜籽[12]和啤酒[13]等中通過(guò)堿水解得到的結(jié)合酚已有研究,但對(duì)于核桃中共價(jià)結(jié)合酚的研究未見報(bào)導(dǎo)。

本文旨在通過(guò)不同濃度的氯化鈉和尿素破壞核桃多酚和核桃蛋白間的作用力,研究核桃多酚與核桃蛋白間的結(jié)合機(jī)制。由于植物多酚的鄰位酚羥基極易被氧化,且對(duì)自由基有較強(qiáng)的捕捉能力,使植物多酚具有很強(qiáng)的抗氧化活性[14]。因此,本文通過(guò)測(cè)定不同結(jié)合方式多酚的抗氧化活性,以期確定主要行使抗氧化功能的多酚種類。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

和田產(chǎn)薄皮核桃 新疆石河子市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);福林酚(2 mol/L) 北京生物科技股份有限公司;DPPH(純度98%)、菲咯嗪-鈉鹽(純度97%) 均出自上海源葉生物科技有限公司;10 kDa超濾膜 上海斯信生物科技有限公司;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

752型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;PHS-3C雷磁pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;Millipore 8050型超濾杯 上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 核桃脫脂粉的制備 采用毛曉英[15]的方法略做改動(dòng)。以和田薄皮核桃為原料,將去殼的核桃仁(不去內(nèi)種皮)粉碎后,采用正己烷以1∶5 (w/v)的料液比浸提脫脂1 h后抽濾,采用相同方法對(duì)濾渣進(jìn)行二次脫脂,濾液為無(wú)色透明時(shí)脫脂結(jié)束,收集濾渣,置于通風(fēng)廚內(nèi)揮干溶劑。將濾渣用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)150目篩,即為核桃脫脂粉,置于冰箱4 ℃冷藏備用。

1.2.1.2 堿提酸沉法制備核桃蛋白 采用毛曉英[15]的方法略改,制備堿提(pH11)蛋白:依據(jù)蛋白堿溶酸沉原理,取核桃脫脂粉3 g,加入去離子水按照1∶26 (w/v)的料液比溶解,用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為11,室溫下磁力攪拌30 min,以4000×g離心25 min,取上清液(上清液實(shí)際顏色為棕色且并不澄清)即為堿提(pH11)蛋白溶液。

制備酸提(pH3.5)蛋白:依據(jù)蛋白堿溶酸沉原理,將上述堿提(pH11)蛋白溶液用2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液pH為3.5,于室溫下磁力攪拌30 min,以4000×g離心25 min,沉淀即為酸提(pH3.5)蛋白。

1.2.1.3 不同結(jié)合組分多酚制備 采用Su[16]和Xu[12]等的方法略作修改,從核桃蛋白中提取不同結(jié)合方式的核桃多酚。取上述堿提(pH11)蛋白溶液50 mL,加入250 mL去離子水進(jìn)行超濾(超濾膜截留分子量10 kDa),透過(guò)膜的部分(P)為游離態(tài)酚,截留下來(lái)的部分(R)作為后續(xù)研究多酚與蛋白結(jié)合機(jī)制的樣品。用250 mL 0.05 mol/L NaCl釋放離子結(jié)合多酚,采用超濾的方法進(jìn)行分離。用0.05 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素共250 mL加入到上一步截留的蛋白溶液中,釋放氫鍵結(jié)合態(tài)多酚,采用超濾的方法進(jìn)行分離。用0.05 mol/L NaCl+8 mol/L尿素共250 mL加入到上一步截留的蛋白溶液,釋放疏水相互作用結(jié)合的多酚,采用超濾進(jìn)行分離。

釋放核桃蛋白共價(jià)結(jié)合的多酚采用以下方法:向上述超濾截留的蛋白溶液中添加4 mol/L NaOH溶液70 ℃堿水解12 h,然后采用超濾進(jìn)行分離,將截留下來(lái)的蛋白溶液(此時(shí)的蛋白溶液經(jīng)堿水解超濾后殘?jiān)鼧O少)添加0.05 mol/L NaCl+8 mol/L尿素共250 mL,然后采用超濾分離,合并兩次濾液,即得共價(jià)結(jié)合態(tài)多酚。將各步驟收集到的多酚溶液調(diào)pH至7,裝入不同棕色試劑瓶中,標(biāo)記并密封,于4 ℃冷藏備用。不同濃度氯化鈉和尿素溶液由圖1依次加入蛋白溶液后在室溫下磁力攪拌1 h,用氮?dú)饧訅涸?.15 MPa條件下進(jìn)行超濾。取酸提(pH3.5)蛋白,重復(fù)上述操作步驟,由于蛋白的酸沉特性,為防止超濾膜堵塞,實(shí)驗(yàn)過(guò)程采用3000 r/min離心,將沉淀與超濾后的滯留液合并,作為下一步多酚提取的樣液。

圖1 pH3.5和pH11條件下不同結(jié)合方式多酚提取流程圖Fig.1 Flow chart of the extraction of different combinations of polyphenols at pH3.5 and pH11注:UF、R和P分別代表超濾、滯留和滲透。

1.2.2 多酚含量測(cè)定 采用蒲成偉等[17]的方法略改。準(zhǔn)確吸取濃度為0.025 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5 mL至10 mL棕色容量瓶中,分別添加250 μL的福林酚溶液,避光反應(yīng)6 min,再向其中加入7% Na2CO3溶液2.5 mL,用蒸餾水定容至10 mL,搖勻避光反應(yīng)90 min后,在波長(zhǎng)為765 nm處測(cè)定吸光度,根據(jù)所得數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程。

取2 mL酚樣(pH3.5和11條件下所得10個(gè)多酚樣品)至10 mL 棕色容量瓶中,依次加入上述溶液,相同條件下測(cè)定吸光度。根據(jù)回歸方程和所測(cè)定的結(jié)果,計(jì)算得出樣品溶液中多酚含量。

式中:C:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,樣品的吸光度所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度,μg/mL;M:樣品的質(zhì)量,g;V1:樣品提取總體積,mL;V2:分析時(shí)用樣品體積,mL;10:稀釋倍數(shù)。

1.2.3 抗氧化性測(cè)定 取20 mL酚樣(pH3.5和pH11條件下所得10個(gè)多酚樣品)至100 mL容量瓶定容,即稀釋5倍。

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力 采用Zhang[18]等人的方法。取2 mL酚樣(上述條件下,稀釋5倍后酚樣,1.2.3.2～1.2.3.4同),加入2mL 62.5 μg/mL DPPH-乙醇(無(wú)水乙醇)溶液,搖勻避光靜置30 min,在波長(zhǎng)為517 nm處測(cè)定吸光度。

式中:A0:空白對(duì)照組吸光度值,Ai:樣品組吸光度值,Ai0:樣品空白對(duì)照組吸光度值。

1.2.3.2 Fe2+螯合能力 采用Karama[19]的方法略改。取2 mL酚樣,加入100 μL 5 mmol/L FeSO4,2 mL蒸餾水和100 μL 5 mmol/L菲咯嗪,混勻后靜置10 min,在波長(zhǎng)為562 nm處測(cè)定樣品吸光度As。用2 mL蒸餾水代替樣品作空白對(duì)照Ac。

1.2.3.3 還原能力的測(cè)定 采用李笑笑[20]的方法略改。取2 mL酚樣,加入2 mL 0.2 mol/L pH6.6 的磷酸鹽緩沖溶液、2 mL 1%鐵氰化鉀,混勻后50 ℃水浴20 min,取出待測(cè)樣,加入2 mL 10%三氯乙酸,將得到的反應(yīng)混合液于3000 r/min離心10 min,取上清液4 mL,加入4 mL蒸餾水和 0.8 mL 0.1%三氯化鐵,振蕩混合均勻,在波長(zhǎng)為700 nm處測(cè)定其吸光度。

1.2.3.4 脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力測(cè)定 采用代沙[21]的方法略改。取1 mL LLS(取1 g卵磷脂溶解于100 mL 10 mmol/L pH7.4的PBS中,冰浴振蕩)、1 mL 400 μmol/L三氯化鐵、1 mL 400 μmol/L抗壞血酸和1 mL酚樣品,充分混勻,避光37 ℃水浴60 min,取出待測(cè)樣,再加入2 mL TCA-TBA-HCl搖勻(三氯乙酸-硫代巴比妥酸-鹽酸混合液:37.5 g TCA、0.925 g TBA、5.25 mL濃鹽酸依次加入250 mL蒸餾水中),90～100 ℃水浴15 min后迅速冷卻,于2000 r/min離心10 min,取上清液在波長(zhǎng)為535 nm測(cè)定樣品吸光度As,用1 mL雙蒸水代替樣品作空白對(duì)照Ac。脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率計(jì)算公式如下。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,繪圖采用Origin 8.5軟件,顯著性分析采用SPSS statisics 23.0單因素ANOVA中的Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品建立沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0942x+0.0131(R2=0.9975),式中:x為多酚質(zhì)量濃度(以沒(méi)食子酸計(jì),μg/mL;y為所對(duì)應(yīng)的吸光度。決定系數(shù)R2=0.9975,濃度在0.625～6.25 μg/mL范圍內(nèi),核桃多酚含量與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2 不同結(jié)合方式多酚含量測(cè)定結(jié)果

五種不同結(jié)合方式多酚溶液中多酚含量測(cè)定結(jié)果如圖2所示。在pH3.5和pH11時(shí),非共價(jià)結(jié)合態(tài)多酚含量分別為11.31、7.74 mg/g,占總酚含量的44.02%、36.75%,核桃多酚與蛋白質(zhì)的主要作用方式為非共價(jià)結(jié)合。共價(jià)結(jié)合態(tài)多酚分別為7.92、7.05 mg/g,占總酚含量的30.83%、33.48%。核桃仁在酸提和堿提條件下分別有74.85%、70.23%多酚通過(guò)化學(xué)鍵與蛋白質(zhì)發(fā)生作用。在pH3.5和pH11時(shí),游離態(tài)多酚的含量分別為6.46、6.27 mg/g,說(shuō)明有25.15%、29.77%的多酚不通過(guò)任何作用力,僅以游離態(tài)形式存在于核桃脫脂蛋白溶液中。

圖2 不同結(jié)合態(tài)多酚含量Fig.2 Polyphenol content in different bound forms注:不同字母表示相同提取pH不同結(jié)合方式 多酚含量之間差異顯著(p<0.05)。

2.2.1 離子鍵結(jié)合 研究中發(fā)現(xiàn)在pH3.5和pH11的蛋白溶液中通過(guò)0.05 mol/L NaCl破壞離子鍵所得多酚含量最少,分別為2.58、1.73 mg/g,Le等[9]研究指出多酚的離子化羥基和羧基位可能與蛋白質(zhì)中帶正電荷的賴氨酸的ε-氨基相互作用,從而在多酚與蛋白之間形成少量的離子鍵。在pH3.5時(shí)通過(guò)氫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合的多酚含量較高,此時(shí)蛋白中大部分官能團(tuán)帶正電荷,而在pH11時(shí),帶正電荷的官能團(tuán)大量減少,例如賴氨酸在pH11時(shí)側(cè)鏈不帶電荷[22],多酚可離子化結(jié)合的蛋白質(zhì)上的位點(diǎn)急劇減少。毛曉英[15]的研究表明核桃蛋白以酸性蛋白為主,等電點(diǎn)集中在pI4.8～6.8之間,少數(shù)的蛋白是堿性蛋白pI8.4～9.0。因此,在pH11時(shí),通過(guò)離子鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合的多酚含量減少。

2.2.2 氫鍵結(jié)合 在pH3.5和pH11的蛋白溶液中通過(guò)0.05 mol/L NaCl和1.5 mol/L尿素破壞氫鍵所得多酚含量分別為4.24、3.60 mg/g。多酚因多羥基結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的親水性,蛋白質(zhì)兼具親水親油性,多酚的親水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的親油基團(tuán)能夠發(fā)生氫鍵作用形成緊密結(jié)構(gòu)[23]。多酚分子中酚羥基、醇羥基、醚鍵等活性基團(tuán),既可以作為氫鍵質(zhì)子給體,也可以作為質(zhì)子受體與蛋白質(zhì)主鏈上肽鍵的羰基、側(cè)鏈上的羥基、胍基、羧基發(fā)生氫鍵結(jié)合[24]。在pH3.5的溶液中通過(guò)氫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合的多酚含量高于pH11的蛋白溶液。一方面可能是蛋白質(zhì)氫原子受體位點(diǎn)在蛋白溶液呈堿性時(shí)不利于氫鍵的形成[16],另一方面,堿溶和酸沉條件下,蛋白質(zhì)在溶液中的存在狀態(tài)不同,可能影響了超濾膜對(duì)多酚的超濾效果,導(dǎo)致pH3.5時(shí)氫鍵結(jié)合組分多酚含量略高于pH11。

2.2.3 疏水相互作用 在pH3.5和pH11的蛋白溶液中通過(guò)0.05 mol/L NaCl和8 mol/L尿素破壞疏水相互作用所得多酚含量分別為4.49、2.41 mg/g。多酚中含有酚羥基和苯環(huán),使其同時(shí)具備了親水性和疏水性,蛋白質(zhì)多肽中的芳香環(huán)或脂肪族側(cè)鏈等氨基酸殘基比較集中的區(qū)域,在水溶液中由于疏水作用而形成了疏水區(qū)域[25]。正因?yàn)檫@些疏水區(qū)域的存在,使多酚與蛋白間發(fā)生了疏水相互作用。Richard等[26]研究結(jié)果表明生物活性多酚與神經(jīng)降壓素通過(guò)疏水特性彼此識(shí)別。在pH3.5的溶液中通過(guò)疏水鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合的多酚含量高于pH11的溶液。在堿性環(huán)境中,蛋白質(zhì)分子易發(fā)生變性和解離,疏水性殘基暴露[27]。理論上應(yīng)有更多疏水性蛋白殘基與疏水多酚相互作用。但黃惠華等[28]研究明膠與單寧酸的絡(luò)合反應(yīng),結(jié)果表明在體系pH為3.5時(shí),兩者反應(yīng)程度最大且產(chǎn)生的絡(luò)合物最多。Mateus[29]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)體系pH為4.5時(shí),即牛血清蛋白等電點(diǎn)附近時(shí),原花青素與牛血清蛋白的結(jié)合程度最大。兩者的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象解釋為蛋白質(zhì)pI附近多酚-蛋白質(zhì)間的交聯(lián)結(jié)合力大于蛋白質(zhì)間排斥力。因此pH3.5時(shí)結(jié)合的多酚含量多,由溶劑破壞作用力所得多酚含量也越高。

2.2.4 共價(jià)鍵結(jié)合 研究中發(fā)現(xiàn)在pH3.5和pH11的蛋白溶液中,分別有7.92、7.05 mg/g的多酚通過(guò)共價(jià)鍵與核桃蛋白相互作用。酚類化合物具有較高的反應(yīng)活性,在堿性條件下能夠被氧化成半醌和醌。醌是一種反應(yīng)性的親電中間體,易受蛋白質(zhì)鏈中的親核分子如賴氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等的攻擊,從而形成交聯(lián)的蛋白質(zhì)聚合物[30]。共價(jià)結(jié)合態(tài)多酚占總多酚含量的30.83%、33.48%,在單個(gè)多酚組分中含量最高(p<0.05)。一方面堿性有氧環(huán)境下多酚形成半醌和醌與蛋白作用,另一方面核桃仁(去除內(nèi)種皮)中本身可能存在結(jié)合態(tài)酚類，都能致使結(jié)合態(tài)酚類含量升高。如Alu’datt等[31]通過(guò)低濃度的強(qiáng)酸和強(qiáng)堿水解得到大豆和亞麻籽結(jié)合酚,亞麻籽結(jié)合酚占總酚含量的20%～30%,大豆結(jié)合酚占10%～20%。在Ross等[32]的試驗(yàn)中干豆結(jié)合態(tài)多酚占總酚含量的94%。但以往的研究中對(duì)這類多酚與蛋白的結(jié)合研究較少,由以上結(jié)果可知,共價(jià)結(jié)合方式在多酚與蛋白結(jié)合中不容忽視。其含量高可能與所選原材料、蛋白與多酚間作用方式和提取多酚時(shí)的作用條件有關(guān),例如提取液、溶劑作用時(shí)間，pH和溫度等。

2.3 不同結(jié)合方式多酚抗氧化性研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力 不同結(jié)合態(tài)多酚對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果如圖3所示,由圖3可知,游離態(tài)多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)(p<0.05),pH3.5和pH11時(shí)的清除能力分別為82.34%、43.68%。在pH3.5時(shí),游離態(tài)多酚的抗氧化性分別是離子結(jié)合、氫鍵結(jié)合、疏水結(jié)合和共價(jià)結(jié)合的6.1、3.3、3.1和14.2倍,在pH11時(shí),分別為2.7、2.6、3.7和8.4倍?？芍坞x態(tài)多酚抗氧化能力明顯高于其他結(jié)合態(tài)多酚。造成這種現(xiàn)象的原因可能是抗氧化性與多酚含量存在相關(guān)性,游離酚含量越高,抗氧化活性越強(qiáng)[18]。另外,游離酚和結(jié)合酚在植物體中存在的位置不同,游離酚主要存在于植物細(xì)胞液泡中,結(jié)合酚主要通過(guò)酯鍵與細(xì)胞壁中木聚糖側(cè)鏈上一些糖殘基相連[33]。結(jié)合方式以及在機(jī)體中行使功能的不同,也有可能造成抗氧化性存在巨大差異。共價(jià)結(jié)合多酚清除自由基能力最低,在pH3.5和pH11時(shí)分別為5.79%、5.23%。在Alu’datt等[31]的研究中,采用堿水解(0.1 mol/L NaOH)和酸水解(0.1 mol/L HCl)所得大豆和亞麻籽的結(jié)合態(tài)多酚抗氧化能力明顯低于游離酚(此實(shí)驗(yàn)中非堿水解提取酚類都為游離酚),與本研究共價(jià)結(jié)合酚抗氧化活性較弱的結(jié)果相一致。

圖3 不同結(jié)合態(tài)多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.3 DPPH radical scavenging activity of different bound polyphenols

2.3.2 Fe2+螯合能力 多酚對(duì)Fe2+的螯合能力測(cè)定結(jié)果如圖4所示,由圖4可知,游離態(tài)多酚對(duì)Fe2+螯合能力最強(qiáng)(p<0.05),不同結(jié)合態(tài)多酚對(duì)Fe2+螯合能力在 pH3.5和pH11條件下分別為游離態(tài)71.88%、49.96%,離子結(jié)合態(tài)11.19%、16.32%,氫鍵結(jié)合態(tài)18.14%、13.3%,疏水結(jié)合態(tài)19.88%、11.70%,共價(jià)結(jié)合態(tài)9.40%、8.56%。在pH3.5條件下,游離態(tài)多酚的抗氧化性分別是其它結(jié)合態(tài)多酚的6.4、4.0、3.6和7.6倍,pH11時(shí)為3.0、3.8、4.3和5.8倍。游離態(tài)多酚的抗氧化活性顯著高于共價(jià)和非共價(jià)結(jié)合態(tài)多酚(p<0.05)。某些酚類物質(zhì)具有特定功能基團(tuán)可以螯合Fe2+,且六元環(huán)結(jié)構(gòu)比五元環(huán)結(jié)構(gòu)與金屬離子形成的螯合物更穩(wěn)定[34]。不同結(jié)合態(tài)酚類的抗氧化性也可能受到自身酚類結(jié)構(gòu)的影響。

圖4 不同結(jié)合態(tài)多酚對(duì)Fe2+的螯合能力Fig.4 Fe2+chelating ability of different bound polyphenols

2.3.3 還原力 多酚還原力測(cè)定結(jié)果如圖5所示,由圖5可知,游離態(tài)多酚吸光度最大,還原力最強(qiáng)(p<0.05)。 pH3.5和pH11游離態(tài)吸光度值分別為1.157、0.857,離子結(jié)合態(tài)吸光度值分別為0.143、0.27,氫鍵結(jié)合態(tài)吸光度值分別為0.415、0.338,疏水結(jié)合態(tài)吸光度值分別為0.438、0.291,共價(jià)結(jié)合態(tài)吸光度值分別為0.367、0.345?？寡趸瘎┦峭ㄟ^(guò)自身的還原作用給出電子從而清除自由基,還原力越強(qiáng),抗氧化活性越強(qiáng)。還原力與其他三種測(cè)定多酚抗氧化活性結(jié)果一致,游離態(tài)多酚的抗氧化能力最強(qiáng)。

圖5 不同結(jié)合態(tài)多酚的還原能力Fig.5 Reduction capacity of different bound polyphenols

2.3.4 脂質(zhì)抗過(guò)氧化性 脂質(zhì)過(guò)氧化主要指生物體內(nèi)多不飽和脂肪酸和膽固醇在自由基作用下發(fā)生氧化。在酸性條件下丙二醛與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成有色化合物,在532 nm有特征吸收值[35]。

多酚抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力測(cè)定結(jié)果如圖6所示,由圖6可知,游離態(tài)多酚抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力最強(qiáng)(p<0.05)。 pH3.5和pH11條件下游離酚抑制率分別為47.71%、32.69%,離子結(jié)合態(tài)多酚抑制率分別為7.6%、10.19%,氫鍵結(jié)合態(tài)多酚抑制率分別為15.59%、14.71%,疏水結(jié)合態(tài)多酚抑制率分別為17.29%、10.21%,共價(jià)結(jié)合態(tài)多酚抑制率分別為11.71%、11.35%。在pH3.5條件下,游離態(tài)多酚的抗氧化性分別是其它結(jié)合態(tài)多酚的6.3、3.1、2.8和4.1倍,pH11條件下分別為3.2、2.2、3.2和2.9倍。多酚可以抑制催化劑的活性,達(dá)到抑制起始自由基傳播的目的。初始型抗氧化劑(AH)通過(guò)與脂質(zhì)自由基L·、烷氧自由基LO·或過(guò)氧自由基LOO·反應(yīng)抑制脂質(zhì)的氧化鏈反應(yīng)?？寡趸瘎┳杂苫腁·也能與過(guò)氧自由基、烷氧自由基反應(yīng)而終止脂質(zhì)氧化反應(yīng)[35]。游離態(tài)多酚的抗氧化能力最強(qiáng)可歸因于游離態(tài)多酚抗氧化活性更高,其在核桃仁中本身以游離態(tài)形式存在,其它結(jié)合態(tài)多酚可能結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。因此游離態(tài)多酚抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力更強(qiáng)。

圖6 不同結(jié)合態(tài)多酚抑制脂質(zhì)過(guò)氧化效果Fig.6 Effects of scavenging lipid peroxidation of different bound polyphenols

抗氧化劑的抗氧化活性主要表現(xiàn)在清除自由基、抑制脂質(zhì)(也可以是蛋白質(zhì)或DNA)的氧化降解、還原力和抑制促氧化劑等方面[35]。究其根本,抗氧化劑通過(guò)阻斷脂質(zhì)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或抑制減緩脂質(zhì)氧化的速率,達(dá)到抗氧化的目的。由以上結(jié)論可知,pH3.5和pH11游離態(tài)酚類含量?jī)H是三種非共價(jià)結(jié)合態(tài)酚類含量的1.4～2.5倍和1.7～3.6倍,略低于共價(jià)結(jié)合態(tài)酚類,但抗氧化能力顯著高于其它結(jié)合態(tài)酚類。由此可知,多酚的抗氧化活性不僅與含量有關(guān),其結(jié)構(gòu)可能也發(fā)揮著重要作用。

3 結(jié)論

酚類化合物通過(guò)與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物絡(luò)合,影響食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。核桃中豐富的蛋白質(zhì)和多酚在加工過(guò)程中發(fā)生相互作用,本研究結(jié)果表明非共價(jià)結(jié)合態(tài)多酚含量>共價(jià)結(jié)合態(tài)多酚含量>游離態(tài)多酚含量,非共價(jià)結(jié)合是核桃多酚與核桃蛋白質(zhì)的主要作用方式?？寡趸钚匝芯拷Y(jié)果顯示,游離態(tài)多酚的抗氧化活性顯著高于其他結(jié)合態(tài)多酚(p<0.05)。本研究為核桃多酚與核桃蛋白互作機(jī)制的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù),為多酚提取及工業(yè)化生產(chǎn)提供新方向,并為提高脫酚核桃蛋白功能性質(zhì)和生物學(xué)特性提供理論依據(jù)。